靜原雞ELOVL5基因遺傳多樣性研究

張 娟，母 童，趙 平，陳佳萍，馮小芳，郭 鵬，武澤文，劉麗元，蔣秋斐，顧亞玲，*

(1.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021； 2.彭陽縣畜牧技術推廣服務中心，寧夏 固原 756500)

靜原雞又名固原雞、靜寧雞，主要分布于寧夏南部地區，是國家畜禽資源保護品種之一，現以彭陽縣數量最多，質量最優。彭陽縣地屬溫帶半干旱大陸季風性氣候，因此靜原雞兼顧耐干旱、易放牧、抗逆性強等優點，且肉質鮮美、細嫩，氨基酸、脂肪酸含量高、膽固醇含量低，是雞肉中首選的綠色營養保健食品[1]。近年來，越來越多的人開始關注膳食營養，對肉品質的要求更是如此。脂肪酸含量是肉品質評價的重要指標之一，有研究表明，雞肉的營養價值、風味與脂肪酸的組成和含量密切相關[2]。經研究發現，靜原雞中含有豐富且對人體有特殊營養價值的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)[3]。極長鏈脂肪酸延伸酶蛋白家族(elongation of very-long-chain fatty acids，ELOVLs)最早來源于酵母ELO家族(ELO1、ELO2、ELO3)，是長鏈脂肪酸(C16、C18)和超長鏈脂肪酸(≥C20)合成的起始酶和限速酶[4]。直至目前，共發現7種蛋白家族成員(ELOVL1-7)，分別參與延長不同長度的脂肪酸鏈，對脂肪酸的代謝進行調控，進而發揮其生物學功能[5]。ELOVL5基因全長897 bp，定位于人體6號染色體，共編碼299個氨基酸，主要參與單不飽和脂肪酸(C16、C18)和多不飽和脂肪酸(C18、C20、C22)的合成[6-7]，并且調控肝臟、脂肪及碳水化合物的代謝，從而影響血脂、血糖濃度[8]。ELOVL5基因在靜原雞肝臟中的表達量最高，其他部位也均有表達，其編碼的脂肪酸還與人體糖尿病、眼病、炎癥性腸疾病及許多其他疾病有關[9-11]。Matsumoto等[12]研究發現，ELOVL5基因與肉牛背膘厚存在顯著相關。郭鵬程等[13]研究表明，ELOVL5基因啟動子序列SNP7(g.-385C>G)中GG基因型、GA基因型與尿素氮、校正奶量顯著相關。目前，國內外大多數研究報道都集中在魚類及ELOVLs家族與人類眾多疾病之間的關系研究[14-18]，在雞上的報道極少。

本研究以寧夏地方優良品種靜原雞為研究對象，利用PCR-SSCP及DNA測序技術對靜原雞ELOVL5基因遺傳多樣性進行檢測，為后期挖掘與肉質相關的位點提供基礎資料，并為我國地方品種雞的種質資源遺傳評定及地方品種分子育種的技術平臺構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品采集

隨機選取彭陽縣朝那雞繁育中心第五世代150日齡靜原雞248只，采用一次性真空采血管翼下靜脈采血3～5 mL，-20 ℃保存備用。

1.1.2 設備

B-120自動顆粒制冰機購自太倉市華美生化儀器廠；電子天平購自梅特勒-托利多中國地區；PCR儀、微量移液槍、低溫高速冷凍離心機均購自德國Eppendorf公司；WD-9406型膠片觀察燈、DYY-6C型電泳儀均購自北京市六一儀器；凝膠數字成像系統購自時代聯想生物科技有限公司；微波爐購自格蘭仕微波爐電器有限公司等。

1.1.3 試劑

Tris-平衡酚，蛋白酶K，6×loading buffer，瓊脂糖，1×TAE均購自北京索萊寶科技有限公司；2×PowerTaqPCR MasterMix，DL2000 DNA Marker均購自北京百泰克生物技術有限公司；丙烯酰胺(Acr)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)、去離子甲酰胺均購自Ameresco公司；Tris購自MP生物醫療公司；四甲基乙二胺(TEMED)、無水乙醇均購自天津市北聯精細化學品開發有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取及檢測

采用苯酚氯仿抽提法提取雞血液中的基因組DNA，用TE緩沖液溶解。將提取出來的DNA通過0.8%的瓊脂糖凝膠檢測并拍照保存。合格DNA樣品于-20 ℃保存備用。

1.2.2 PCR引物設計及合成

根據NCBI上提供的原雞ELOVL5(登錄號：NC_006090.4)基因序列，通過Primer Premier 5.0軟件設計引物(引物序列見表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增

PCR擴增反應總體系為20.0 μL：滅菌超純水7.4 μL，模板0.8 μL(50～100 ng·μL-1)，上下游引物各0.4 μL(10 pmol·L-1)，2×PowerTaqPCR Master Mix 11.0 μL(5 U·μL-1)。靜原雞ELOVL5基因exon2、intron2和exon5 PCR擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，退火溫度見表1，72 ℃ 45 s，30個循環，72 ℃ 8 min。PCR擴增產物檢測：取3.0 μL擴增產物，上樣于1%瓊脂糖凝膠，以DL 2 000 DNA Marker作為對照，100 V電壓15 min，凝膠成像儀觀察檢測結果。

表1ELOVL5基因引物及擴增區域

Table1The primer and amplified region forELOVL5 gene

基因Gene擴增區域Amplified regions引物序列Primer sequences(5′-3′)退火溫度Tm/℃產物長度Product length/bpELOVL5Exon2F: GAGTATCTGTCTGCAATTTTTGT50.3262R: TTTCTTATGCTCTAGTGTGTGTTIntron2F: TTGAAGGTCATCAAGTCGAACTGCA59.7304R: GCAAATCTGTTTATCAAGGGCTACGExon5F: TGTGGGAAGGTGTGGTGATGA56.9350R: GGCCTCTGATGCAAGCATATC

1.2.4 PCR-SSCP檢測

取2.0 μL PCR擴增產物，加入8.0 μL變性緩沖液，含980 μL去離子甲酰胺，20 μL 0.5 mol·L-1EDTA，少量溴酚藍和二甲苯青藍(一般7～8 μL)，混勻，98 ℃變性10 min，冰浴10 min。將變性后的PCR產物，上樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=29∶1)，電泳條件見表2。

1.2.5 產物測序

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分型，挑取不同帶型對應的擴增產物送去生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.6 數據統計分析

通過BioEdit軟件進行序列比對，找出突變位點。運用Popgen軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)和卡方值，利用PIC軟件計算多態信息含量。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

靜原雞全基因組DNA經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖1所示，其條帶清晰明亮，無拖帶。通過紫外分光光度計測其D260/D280為1.6～1.8，無DNA降解，沒有蛋白、外源核酸及其他雜質污染，可以用于后續試驗。

2.2 PCR擴增結果

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后3對引物分別得到1條清晰且單一、與目的片段大小一致的片段，且無引物二聚體及非特異性條帶，可進行后續SSCP分析，結果見圖2。

表2ELOVL5基因PCR-SSCP電泳條件

Table2Electrophoresis conditions of PCR-SSCP forELOVL5 gene

基因Gene擴增區域Amplified regions預電泳Pre-electrophoresis高電壓High voltage電泳ElectrophoresisELOVL5Exon2250 V, 30 min250 V, 10 min100 V, 11 hIntron2250 V, 30 min250 V, 10 min100 V, 14 hExon5250 V, 30 min250 V, 10 min100 V, 20 h

1～9，不同個體的DNA樣。1-9, DNA samples from different individuals.圖1 靜原雞全基因組DNA提取Fig.1 The genomic DNA extraction of Jingyuan chicken

2.3 PCR-SSCP檢測結果

如圖3所示，將3對引物對應的PCR產物分別進行SSCP檢測，結果在ELOVL5基因 exon2和exon5擴增片段上分別檢測出一種帶型。在ELOVL5基因intron2擴增片段上共檢測到2種帶型，分別為AA和AG。隨機取不同帶型的2個PCR產物回收純化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

M， DL2000 DNA marker；1～18， 不同個體的PCR樣品。M, DL2000 DNA marker; 1-18, PCR samples from different individuals.圖2 ELOVL5基因各位點PCR檢測結果Fig.2 Detection of PCR products in ELOVL5 gene

圖3 ELOVL5基因各位點SSCP檢測結果Fig.3 Detection of SSCP in ELOVL5 gene

2.4 等位基因序列比對分析

與NCBI公布的原雞ELOVL5基因序列(NC_006090.4)進行比對，發現靜原雞ELOVL5基因exon2和exon5引物擴增片段均無多態性，基因序列與原序列均一致，結果如圖4、圖5所示。靜原雞ELOVL5基因intron2引物擴增片段多態性是由內含子區的核苷酸點突變造成的，等位基因序列比對如圖6，其中等位基因A存在g.88620433+1683G>A的轉換。

圖4 ELOVL5基因exon2 等位基因序列比對Fig.4 The alleles sequence alignment of ELOVL5 gene exon2

圖5 ELOVL5基因exon5等位基因序列比對Fig.5 The alleles sequence alignment of ELOVL5 gene exon5

圖6 ELOVL5基因intron2等位基因序列比對Fig.6 The alleles sequence alignment of ELOVL5 gene intron2

2.5 ELOVL5基因SNPs位點遺傳特性分析

ELOVL5基因intron2遺傳多態性分析見表3和表4。在靜原雞ELOVL5基因intron2中基因A為優勢等位基因，基因頻率為0.92。基因型AA為優勢基因型，基因型頻率為0.84。在248個靜原雞群體中沒有發現含純合GG型的個體。群體遺傳學分析表明：該位點純合度較高，為0.84，PIC為0.14(PIC<0.25)，呈低度多態。卡方適合性檢驗結果表明，靜原雞ELOVL5基因intron2突變未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表3ELOVL5基因內含子2等位基因頻率和基因型頻率

Table3Allele frequency and genotype frequency ofELOVL5 gene intron 2

基因型個數頻率等位基因頻率GenotypeNumberFrequencyAlleleFrequencyAA2080.84A0.92AG400.16G0.08

表4ELOVL5基因內含子2遺傳多態性參數

Table4Genetic polymorphism parameters ofELOVL5 gene intron 2

多態性位點遺傳多態性參數靜原雞PolymorphismGenetic polymorphism parametersJingyuan chickenELOVL5基因第2內含子純合度Homozygosity(Ho)0.84ELOVL5 intron2雜合度Heterozygosity(He)0.16有效等位基因Effective number of alleles(Ne)1.17多態信息含量Polymorphism information content(PIC)0.14卡方值Chi-Square(X2)1.86

3 討論

生物體遺傳多樣性主要由于其生存環境及病原體壓力驅動導致基因水平上的差異所致[19]。Matsumoto等[12]研究表明ELOVL5基因g.-110T>C是肉牛育種一個有用的遺傳標記。ELOVL5基因intron5多態性還與鯉魚體重增加顯著相關，可以將EOLVL5延伸酶基因可作為鯉魚分子育種的候選基因[20]。Shi等[21]在山羊乳腺上皮細胞中通過下調或過表達ELOVL5基因，三酰甘油的含量不會改變，突出了ELOVL5基因在反芻動物乳腺中16C和18C不飽和脂肪酸延伸中的重要作用。ELOVL5基因還參與蛋雞中N-3和N-6長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成[22]。本研究運用PCR-SSCP技術對靜原雞ELOVL5基因的遺傳多樣性進行檢測，結果發現ELOVL5基因exon2和exon5擴增片段均未發生堿基突變，無多態性，表明靜原雞ELOVL5基因exon2和exon5的遺傳性狀比較穩定，也可能由于此區域曾發生過變異，但由于該個體對當時的環境不夠適應以及自身抗病、耐寒等方面存在缺陷，而逐漸被自然或人為淘汰。同樣，母童等[3]在靜原雞ELOVL2基因exon6擴增片段上也未發現突變位點，說明靜原雞在遺傳進化上趨于穩定。與原雞ELOVL5基因序列比對后發現在靜原雞ELOVL5基因intron2擴增片段上僅存在g.88620433+1683G>A的轉換，該位點的突變可能在靜原雞肉質方面及抗旱耐寒等優良性狀的基因表達調控方面具有一定作用，具體機制還有待后續進一步研究。

動物群體內的個體間差異主要與遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)、多態信息含量(PIC)等有關，遺傳變異越大，選擇的潛力就越大。在靜原雞ELOVL5基因intron2擴增片段上共檢測到2種基因型，分別為AA、AG，純和度(0.84)遠高于雜合度(0.16)，表現純合子優勢，因此在環境中的表現型趨于穩定。本研究248個靜原雞群體中沒有發現含純合GG型的個體，可能由于長期的自然選擇而被淘汰。靜原雞的PIC值為0.14(PIC<0.25)，屬低度多態。卡方適合性檢驗結果表明靜原雞ELOVL5基因intron2突變未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，說明這個位點保守性較高，可能受當地群眾長期人工選育的影響。