少孢節叢孢菌XJ-A1幾丁質酶AO-483基因的克隆及生物學活性

貢莎莎，孟慶玲，*，喬 軍，鐘文強，黃運福，張國武，陳 英，才學鵬

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832003； 2.中國農業科學院 蘭州獸醫研究所，甘肅 蘭州 730046)

捕食線蟲真菌(Nematophagousfung)一般分為捕食菌物、內寄生菌物、機會菌物和產毒素菌物，能捕捉、寄生、定植和產生毒素，殺死線蟲，涉及到真菌界的壺菌門、接合菌門、子囊菌門、擔子菌門、有絲分裂菌類和假菌界的卵菌門[1-2]，種類繁多，在生物防控線蟲方面擁有巨大的價值和潛力。

少孢節叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)是一種典型的捕食線蟲真菌，能夠產生黏性菌網捕捉線蟲。在侵染線蟲過程中，少孢節叢孢菌可分泌蛋白酶、幾丁質酶和膠原酶等胞外水解酶，與捕食結構共同作用從而高效地完成線蟲的固定、角質層的入侵以及宿主細胞的降解等過程[3-6]。2011年，Yang等[3]對經線蟲誘導產生捕食器官的少孢節叢孢菌進行基因組學分析，預測出16個具有糖苷水解酶18家族幾丁質酶結構特征的幾丁質酶基因[4]，發現這些幾丁質酶在碳源缺乏或幾丁質底物存在時表達量明顯上調，提示幾丁質酶在少孢節叢孢菌捕食線蟲的過程中可能發揮重要作用。然而，目前對少孢節叢孢菌的幾丁質酶生物學功能及其作用機制尚不清楚。

本研究對少孢節叢孢菌新疆分離株幾丁質酶AO-483基因進行克隆和分子特征分析，構建原核表達載體，進行原核表達重組融合蛋白；采用DNS還原糖法檢測通過Ni-NAT親和層析柱純化的重組幾丁質酶活性，并將其作用于秀麗隱桿線蟲Ⅰ期和Ⅳ期幼蟲以驗證其生物學活性，為進一步揭示幾丁質酶AO-483在少孢節叢孢菌捕食線蟲過程中的作用及機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及培養基

少孢節叢孢菌新疆分離株(ArthrobotrysoligosporaXJ-A1)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、大腸埃希菌BL21菌株(DE3)和pET32a(+)質粒由石河子大學預防獸醫學實驗室保存；反轉錄試劑盒、pMD19-T載體、His融合蛋白純化柱購自日本TaKaRa公司；EZ柱式真菌RNA抽提試劑盒購自上海生物工程有限公司；透析袋購自廣州東盛生物科技有限公司；鼠抗His抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京全氏金生物技術有限公司；DNS試劑購自北京生東科技有限公司；幾丁質購自上海瑞永生物科技有限公司；NGM培養基參考文獻[7]配制。

1.2 幾丁質酶基因AO-483cDNA的克隆及序列分析

按照RNA提取試劑盒說明書提取少孢節叢孢菌XJ-A1分離株RNA，利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，進行RT-PCR擴增。引物由Primer 5設計，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。上游引物F: 5′-CCGGAATTCATGCCGCCAGTCCTCCC-3′；下游引物R: 5′-CGAGCGGCCGCTTATTCCTGGGCCTCTAAGCC-3′(下劃線部分分別為EcoRI和NotI酶切位點)。反應體系：PCR Mixture 8 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，補足超純水至20 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，63 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，共35個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收后與pMD19-T連接，轉化至大腸埃希菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，提取重組質粒pT-AO483進行測序。利用在線生物分析軟件對AO-483基因及其編碼蛋白進行序列分析。

1.3 原核表達質粒pET32a-A0483的構建

用EcoRI和NotI分別對pMD19-AO483和pET32a(+)質粒進行雙酶切，回收pET32a載體片段和AO-483目的片段，在T4 DNA 連接酶作用下16 ℃過夜連接后轉化入E.coliDH5α感受態細胞中，經氨芐青霉素抗性篩選和菌液PCR驗證后獲得重組質粒pET-A0483。

1.4 目的蛋白的誘導表達及SDS-PAGE和Western blot鑒定

將重組質粒pET-AO483轉化入大腸埃希菌BL21(DE3)感受態細胞中，取陽性克隆菌液200 μL接種于200 mL含氨芐青霉素抗性的LB培養液中，37 ℃，180 r·min-1過夜培養至D600為0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol·L-1的誘導劑IPTG進行誘導，6 h后收集菌體，進行SDS-PAGE分析，并以小鼠抗少孢節叢孢菌多克隆血清抗體為一抗，HRP標記的羊抗小鼠IgG為二抗進行Western blot鑒定。

1.5 重組幾丁質酶AO-483的純化

將收集的菌體用細胞裂解液懸浮后反復凍融，離心收集沉淀，加10 mL 8 mol·L-1尿素后，于室溫放置2 h，用Ni-NTA親和層析柱進行純化，然后將純化蛋白AO-483轉移至透析袋中，分別在6、4、2、1 mol·L-1尿素及去離子水中透析6～8 h，然后用蔗糖濃縮3 h后，收集透析袋中蛋白。

1.6 重組幾丁質酶AO-483酶活性測定

1.6.1 N-乙酞葡萄糖胺(NAG)標準曲線的繪制

配制濃度為1 mg·mL-1的NAG標準液，準確取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL分別加入到10 mL的試管中，并分別補加超純水至2 mL后加入3 mL DNS試劑。以NAG濃度為橫坐標、不同濃度的NAG反應液(3個重復)在540 nm處吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.6.2 重組幾丁質酶AO-483活性測定

采用DNS(二硝基水楊酸)法測還原糖含量來測定重組酶活性，參照文獻[8]制備膠體幾丁質，參考文獻[9]以膠體幾丁質為底物測定酶活性。取200 μL粗酶液和200 μL膠體幾丁質混勻，37 ℃反應30 min后加入600 μL DNS試劑反應，取上清200 μL于540 nm處測D值。在此反應體系下每生成1 μg NAG所需的酶量定義為1個幾丁質酶活力單位。

1.6.3 重組幾丁質酶AO-483作用于秀麗隱桿線蟲幼蟲

將制備的秀麗隱桿線蟲Ⅰ期及Ⅳ期幼蟲懸液[7]分別與等量的重組幾丁質酶AO-483混勻，對照組將幼蟲懸液分別與等量的PBS緩沖液混勻，置于37 ℃，作用0、0.5、1、6、12、24、36 h時分別取400 μL，利用 DNS試劑測定NAG含量，并通過顯微鏡觀察重組酶作用于幼蟲后其形態學變化，分析重組蛋白酶的生物學活性。

2 結果與分析

2.1 少孢節叢孢菌AO-483基因的RT-PCR擴增與克隆

利用特異性引物通過RT-PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的基因AO-483大小為930 bp，與GenBank已公布的少孢節叢孢菌標準株(ATCC 24927)AO-483 cDNA大小一致(圖1)。

2.2 少孢節叢孢菌幾丁質酶AO-483基因及編碼蛋白分析

序列分析發現(圖2)，AO-483基因全長930 bp，編碼309個氨基酸，與少孢節叢孢菌標準株(ATCC 24927)幾丁質酶AO-483基因序列同源性為96.88%，氨基酸序列同源性為97.73%。AO-483基因編碼蛋白具有1個Glyco-hydro-18結構域(位于20～297位氨基酸)；催化活性區域位于17～281位，其特征序列為第96～100位的GMLGG為底物結合位點，第132～140位的LDGLDLDVE為水解酶催化活性位點。此外，還有5個CKⅡ磷酸化位點(位于66～69、107～110、185～188、213～216、253～256位氨基酸)，4個N端 ?；稽c(位于96～101、209～214、239～244、266～271位氨基酸)，1個PCK磷酸化位點(位于113～115位氨基酸)。SWISS-MODEL分析顯示(圖3)，幾丁質酶AO-483具有典型的GH18幾丁質酶三磷酸異構酶桶形結構域。

M，DL2000 DNA marker；1～3，RT-PCR擴增產物。M，DL2000 DNA marker；1-3，Amplification products of RT-PCR.圖1 AO-483基因RT-PCR擴增結果Fig.1 RT-PCR product of AO-483 gene

2.3 重組質粒pET-AO483的雙酶切鑒定結果

用EcoR I和NotI對重組質粒pET-AO483進行雙酶切，獲得5 874 bp和930 bp大小的2條核酸條帶，與預期結果一致(圖4)，證實重組質粒pET-AO483構建成功。

2.4 重組蛋白SDS-PAGE和Western blot分析

如圖5所示，表達產物經SDS-PAGE分析后，在相對分子質量約52 ku處可見特異性反應條帶，分子量與預期值相同；用鎳柱純化的蛋白酶出現與預期大小一致的單一蛋白條帶。Western blot分析表明，表達的重組蛋白能與小鼠抗少孢節叢孢菌多克隆血清抗體發生特異性反應。

2.5 重組幾丁質酶AO-483酶活性研究

根據NAG標準曲線計算，以膠體幾丁質為底物，檢測重組幾丁質酶AO-483活性為223.31 U·mL-1。將重組幾丁質酶液分別作用于Ⅰ期幼蟲和Ⅳ期幼蟲，利用DNS試劑測定該反應過程中能否產生及能產生多少還原糖。結果發現，對照組未檢測到還原糖產生，而試驗組作用于Ⅰ期幼蟲6 h后，在反應液中檢測到還原糖產生，隨著反應時間的增長，產生的還原糖量越多，分別為154.08、188.69、189.46、191.77 μg。作用于Ⅳ期幼蟲12 h后，才能檢測到還原糖產生，還原糖量也隨著反應時間的增長而增多，分別為151.00、165.62、181.77 μg。

2.6 重組幾丁質酶AO-483對秀麗隱桿線蟲幼蟲的降解作用

重組幾丁質酶液作用Ⅰ期和Ⅳ期幼蟲后，發現試驗組Ⅰ期幼蟲在6 h時全部死亡，蟲體體壁皺縮破裂，至12 h時體壁組織發生降解，36 h時大部分體壁組織發生降解；對照組Ⅰ期幼蟲初期未見異常，蟲體繼續發育，后期蟲體活力下降，運動緩慢，但體壁完整(圖6)。與Ⅰ期幼蟲的對照組幼蟲類似，試驗組Ⅳ期幼蟲在6 h時表現為活力下降，運動緩慢，至12 h時全部死亡，蟲體體壁部分發生降解，至36 h時大部分體壁組織發生降解；對照組Ⅳ期幼蟲初期未見異常，蟲體繼續發育，后期蟲體僵直，活力下降，但體壁完整(圖7)。

圖2 AO-483基因編碼蛋白結構域模式圖Fig.2 Domains of AO-483 gene encoding protein

圖3 AO-483基因編碼蛋白三級結構預測Fig.3 Prediction of tertiary structure of AO-483 gene encoded protein

M，DL 5 000 DNA marker；1，雙酶切pET-AO483重組質粒；2，pET-AO483重組質粒。M，DL 2 000 DNA marker；1，Double enzyme digestion for identification of recombinant of pET-AO483；2，Recombinant of pET-AO483.圖4 重組質粒 pET-A0483雙酶切鑒定Fig.4 Restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid pET-AO483

M，融合蛋白表達量； 1，pET32a空載體SDS-PAGE分析結果；2～4，重組載體pET-AO483誘導6 h SDS-PAGE分析結果；5，純化的重組酶AO-483 SDS-PAGE分析結果；6，未純化的重組酶AO-483 Western blot分析結果；7，純化的重組酶AO-483 Western blot分析結果。M，Expression of fusion protein；1，SDS-PAGE analysis results of pET32a no load induced protein expression；2-4，SDS-PAGE analysis results of expression of pET-AO483 recombinant was induced for 6 h；5，SDS-PAGE analysis results of purified recombinant enzyme AO-483；6，Western blot analysis results of unpurified recombinant enzyme AO-483；7，Western blot analysis results of purified recombinant enzyme AO-483.圖5 重組蛋白AO-483 SDS-PAGE和Western blot分析結果Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant protein AO-483

3 討論

已有研究表明，作為線蟲的自然天敵，捕食線蟲性真菌分泌的胞外水解酶絲氨酸蛋白酶和幾丁質酶在其捕食線蟲過程中可能發揮著降解蛋白質和幾丁質的重要作用。目前，已經從捕食線蟲性真菌少孢節叢孢菌中分離鑒定的絲氨酸蛋白酶如PⅡ、Aoz1、P186等[10-11]，并且對其理化性質、作用底物及降解線蟲活性開展了研究，證實了在捕食線蟲的過程中絲氨酸蛋白酶對角質層的侵入、宿主細胞的降解有重要的生物學作用。然而，目前對于捕食線蟲性真菌幾丁質酶的研究還較少。已有研究發現，通過基因組序列分析鑒定少孢節叢孢菌中有16個幾丁質酶(AO-379、AO-406、AO-486、AO-492、AO-576、AO-587、AO-190、AO-483、AO-59、AO-342、AO-427、AO-31、AO-14、AO-223、AO-229和AO-801)，但其結構與功能尚不清楚[4]。

幾丁質酶廣泛存在于微生物、植物、動物中，典型的GH18幾丁質酶家族一般都含有信號肽、幾丁質酶催化域、幾丁質結合域及1個短的C端區域結構，部分幾丁質酶還含有幾丁質酶插入結構域[12-19]。本研究通過對具有強捕食活性的少孢節叢孢菌新疆分離株XJ-A1的幾丁質酶AO-483基因進行分子特征分析發現，AO-483屬于糖苷水解酶18家族，其含有幾丁質底物結合位點GMLGG和幾丁質酶催化活性位點LDGLDLDVE，與其他典型的GH18幾丁質酶不完全相同。

圖6 重組幾丁質酶AO-483作用秀麗隱桿線蟲Ⅰ期幼蟲后蟲體形態學觀察Fig.6 Morphological observation of Caenorhabditis elegans larvae stage 1 treated by recombinant AO-483

圖7 重組幾丁質酶AO-483作用秀麗隱桿線蟲Ⅳ期幼蟲后蟲體形態學觀察Fig.7 Morphological observation of Caenorhabditis elegans larvae stage 4 treated by recombinant AO-483

幾丁質是線蟲的體壁和蟲卵外殼的重要組成成分，能發揮屏障保護作用，使蟲卵及線蟲抵御外界不良環境。Waller等[20]認為，捕食線蟲性真菌對Ⅲ期幼蟲的捕獲能力更強；Grant等[21]認為，捕食線蟲性真菌分泌的GH18幾丁質酶能夠降解根結線蟲Ⅰ期幼蟲的角質層從而抑制其生長。本研究中，將重組AO-483酶液作用于秀麗隱桿線蟲幼蟲，利用DNS試劑在反應6 h的Ⅰ期幼蟲反應液以及反應12 h的Ⅳ期幼蟲反應液中檢測到還原糖產生，表明重組酶AO-483對于線蟲的幾丁質成分具有降解作用。同時，通過對Ⅰ期幼蟲以及Ⅳ期幼蟲的形態學觀察也發現，重組酶對Ⅰ期幼蟲降解能力強于Ⅳ期幼蟲。本研究結果提示，少孢節叢孢菌幾丁質酶AO-483在降解線蟲過程中發揮了重要的作用，為進一步研發動物消化道線蟲病新型生物防控制劑提供了科學依據。