犢牛脂肪干細胞的分離、培養與鑒定

王帥帥，張 才，2，*，孟素丹，黃永志，朱雪敏，王玉琴，2，楊自軍

(1.河南科技大學 動物與科技學院，河南 洛陽 471000； 2.河南省肉羊繁育工程技術研究中心，河南 洛陽 471000)

我國奶牛的存欄量位于世界前列，奶牛圍產期的營養代謝性疾病日趨嚴重，脂肪肝病和酮病給奶牛養殖業造成巨大的損失。奶牛脂肪細胞是奶牛營養代謝病研究的重點之一，成熟的脂肪細胞作為終末分化的細胞，體外分離比較困難，獲得率和存活率較低。通過分離奶牛脂肪干細胞，體外定向誘導分化為脂肪細胞，可有效解決脂肪細胞體外分離的難題。已有國內學者從荷斯坦牛中分離出前體脂肪細胞或原代脂肪細胞，并成功誘導分化成為脂肪細胞[10-11]，但并未對分離的細胞進行鑒定。

本研究采用組織剪碎法結合胰蛋白酶消化法消化、收集荷斯坦犢牛腎周脂肪組織中的脂肪干細胞。通過體外培養、表面標志物及生物學功能鑒定等方法對分離得到的細胞進行鑒定，以期為奶牛營養代謝病的相關研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1日齡健康荷斯坦雄性牛犢由生生牧業有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；速眠新購自圣達動物藥品有限公司；胰蛋白酶、膠原蛋白酶Ⅰ、二甲基亞砜(DMSO)、CCK8試劑盒、IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、吲哚美辛、 β-甘油磷酸鈉購自北京Solarbio公司。鼠抗兔Vimentin、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90單克隆抗體，山羊抗兔IgG抗體，CY3顯色試劑盒，DAPI染液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；地塞米松、胰島素、維生素C(VC)購自辰欣藥業有限公司。

1.2.2 主要儀器

CO2恒溫培養箱，上海三發科學儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡，德國Carl Zeiss AG公司；低溫高速離心機、酶標儀，美國Thermo Fisher公司；生物安全柜，上海博迅醫療生物儀器有限公司。

二是加強行業管理，建立以行業自律為主的會計職業道德管理機構，對出具虛假會計信息的事務所予以重罰，直至取消其執業資格，堅決打擊違規者，凈化行業空氣，重塑行業信用。

1.3 試驗方法

1.3.1 犢牛脂肪干細胞的分離培養

犢牛稱重，靜脈注射適量的速眠新，全麻后保定，對手術通路進行剃毛、消毒等處理，在無菌條件下獲取腎周脂肪組織后轉移至超凈工作臺。先用PBS清洗3次，在顯微鏡下仔細去除組織表面的血管、筋膜、結締組織等，剪成1 mm3的小塊。使用PBS沖洗3次后移入大離心管內，加入0.25%的胰蛋白酶消化液37 ℃恒溫消化1 h，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，普通培養基(改良1640培養基+100 U·mL-1青霉素+0.1 mg·mL-1鏈霉素)重懸細胞再次離心，重復3次該操作。當觀察到組織呈云霧狀或乳糜狀時，加入含血清培養基終止消化。以180目細胞篩網過濾去除未消化組織，1 000 r·min-1離心10 min。PBS漂洗，離心去上清，加入完全培養基(含體積分數為10%胎牛血清的普通培養基)輕輕吹打成單細胞懸液，備用。

1.3.2 犢牛脂肪干細胞原代培養及傳代培養

使用貼壁培養基(完全培養基+5 μg·mL-1胰島素+0.5μg·mL-1地塞米松)調整細胞濃度至2×104個·mL-1，接種5 mL細胞懸液于25 cm2細胞培養瓶中，放于CO2培養箱中(37 ℃、5% CO2、95%濕度)培養。24 h后首次換液，除去未貼壁細胞及雜質，之后每3 d換液1次。待細胞貼壁生長融合達到80%～90%時，經胰蛋白酶消化后，以1∶3進行傳代培養。

1.3.3 犢牛脂肪干細胞表面蛋白鑒定

取第5代細胞，經胰蛋白酶消化后計數，調整細胞密度至每孔1×104個，接種12孔板中(放入細胞爬片)，培養30 min后加入1.5 mL完全培養基，每3 d換液1次。待細胞生長融合達80%時吸去培養基，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS清洗3次，加100 μL破膜工作液，室溫孵育10 min，PBS清洗3次，血清封閉30 min，加入大鼠抗兔Vimentin、CD31、CD34、CD44、CD45和CD90單克隆抗體，空白對照用PBS代替，平放于濕盒內4 ℃過夜。次日取出，用PBS清洗3次，加入CY3標記的山羊抗兔IgG抗體，37 ℃避光孵育50 min，之后用PBS清洗3次，加入DAPI染液，避光室溫孵育10 min。細胞爬片稍微甩干后用抗熒光淬滅封片劑封固在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 成脂誘導分化

取第10代細胞，調整細胞密度至每孔2×104個，接種于12孔板中。處理組和對照組各6孔，加入完全培養基，待細胞貼壁生長融合至70%時，處理組改用成脂誘導培養基(完全培養基+1 μmol·L-1地塞米松+10 μg·L-1胰島素+500 μmol·L-1IBMX+200 μmol·L-1吲哚美辛)培養，對照組用完全培養基培養，每2 d換液1次。培養21 d后，吸出培養基， PBS沖洗3次，室溫下加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS沖洗3次，加入油紅O染液，錫箔紙包被避光染色20 min，PBS沖洗3次，倒置顯微鏡下觀察。

1.3.5 成骨誘導分化

取第10代細胞，調整細胞密度至每孔2×104個，接種12孔板中。處理組和對照組各6孔，加入完全培養基，待細胞貼壁生長融合至70%時，處理組改用成骨誘導培養基(完全培養基+50 mg·L-1VC+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+0.1 μmol·L-1地塞米松)培養，對照組用完全培養基培養，每2 d換液1次。培養21 d后，吸出培養基，用150 mmol·L-1NaCl沖洗3次， 4 ℃下用70%乙醇固定1 h，室溫下用2%茜素紅染色10 min，倒置顯微鏡下觀察。

1.3.6 細胞增殖情況

取第5代、第10代細胞，用胰蛋白酶消化液消化細胞制成單細胞懸液，調整細胞密度至1×104個·mL-1，接種于96孔板。以天數為單位分為8組，每組6個重復，其余6孔加入等量培養基作為對照組。接種24 h后，CCK-8法檢測細胞增殖情況，用酶標儀在450 nm處測定每24 h的吸光度值，連續測量7 d，制作細胞生長曲線。

2 結果與分析

2.1 細胞形態學觀察

犢牛脂肪干細胞接種后24 h已經貼壁生長，形態呈梭狀逐漸展開，開始少量增殖(圖1-A)；48 h后細胞已經伸展為梭形、多角形，細胞數量增多(圖1-B)；72 h后細胞大量增殖，呈鋪開生長(圖1-C)；96 h后細胞呈纖維細胞樣，并且呈旋渦狀，細胞融合達到50%左右(圖1-D)。隨著培養時間的增加，細胞融合度越來越高(圖1-E、1-F)。

A～F分別表示細胞接種后24 、48、72、96、120、144 h時的細胞形態。A-F represented morphology of adipose-derived stem cell which were cultured 24， 48， 72， 96， 120， 144 h.圖1 犢牛脂肪干細胞的形態Fig.1 Morphology of adipose-derived stem cells of calves

2.2 犢牛干細胞表面蛋白鑒定

由圖2可知，經體外培養的第5代犢牛脂肪干細胞細胞核DAPI染色呈藍色；加入大鼠抗兔Vimentin、CD34、CD44、CD90單克隆抗體后， CY3染色呈紅色(圖A2、C2、D2、F2)，表明細胞Vimentin、CD34、CD44、CD90呈陽性表達；加入CD31、CD45單克隆抗體后，CY3未染色，表明細胞CD31、CD45呈陰性表達。

2.3 犢牛干細胞的成脂誘導分化

由圖3可以看出，細胞經成脂誘導21 d后，細胞形態由長梭形逐漸變為不規則的多邊形、三角形，最后變為不規則的鈍圓形。細胞間及胞內出現了折光率較強的類似于脂滴樣的物質(圖3-C)，經油紅O染色后，經誘導的細胞被染成紅色(圖3-D)。未經誘導的細胞培養21 d后，細胞仍然呈長梭形、旋渦狀生長(圖3-A)，油紅O染色呈陰性(圖3-B)。

2.4 犢牛脂肪干細胞成骨誘導分化

由圖4可以看出，細胞經成骨誘導21 d后，細胞結節中心的細胞發生融合，細胞結構消失，出現明顯的骨化結(圖4-C)；茜素紅染色后，骨化結呈現暗紅色(圖4-D)。未經誘導的細胞培養21 d后，細胞沒有發生形態上的改變，也沒有堆積和產生骨結節(圖4-A)；茜素紅染色后，細胞未出現暗紅色的結節(圖4-B)。

2.5 犢牛脂肪干細胞生長曲線

從圖5可以看出，第5代和第10代犢牛脂肪干細胞在第1天、第2天處于生長潛伏期，第3天至第6天基本處于生長對數期，第7天后基本處于生長平臺期。這說明犢牛脂肪干細胞在體外培養條件下細胞增殖比較穩定，隨著細胞傳代的增加，生長狀態基本無異常。

A1～F1為DAPI染色，A2～F2為CY3染色，A3～F3為DAPI復染CY3。A1-F1 represented DAPI staining， A2-F2 represented CY3 staining， A3-F3 represented DAPI redyeing CY3.圖2 犢牛脂肪干細胞免疫熒光染色Fig.2 Immunofluorescent staining results of the calf ADSCs

A、B，對照組染色前、后；C、D，處理組染色前、后。A and B represented cell morphology of control group before and after Oil Red O staining， C and D represented cell morphology of experimental group before and after Oil Red O staining.圖3 犢牛脂肪干細胞成脂誘導染色結果Fig.3 Adipogenic induced staining results of the calf ADSCs

A、B，對照組染色前、后；C、D，處理組染色前、后。A and B represented cell morphology of control group before and after alizarin red staining， C and D represented cell morphology of experimental group before and after alizarin red staining.圖4 犢牛脂肪干細胞成骨誘導染色結果Fig.4 Osteoginic induced staining results of the calf ADSCs

圖5 各代脂肪干細胞生長曲線Fig.5 Growth curves of adipose-derived stem cells of different passages

3 討論

近些年對脂肪干細胞的研究主要集中在通過人體吸脂手術獲得脂肪干細胞來進行體外培養和多向誘導分化，從而用于再生醫學和美容業[13-15]。動物體脂肪干細胞研究主要集中在大鼠及兔等小動物，用于肝損傷模型及骨折模型等研究[16-17]，關于奶牛等大型家畜脂肪干細胞的報道較少[18-19]。殷立恒[10]從荷斯坦犢牛腹腔大網膜和腸系膜脂肪組織中分離培養得到1種脂肪前體細胞，誘導分化為成熟脂肪細胞，并檢測到脂肪前體細胞和成熟脂肪細胞中成脂相關因子的表達。張世奇[11]從荷斯坦犢牛腹腔大網膜和腸系膜脂肪組織中分離出原代脂肪細胞，通過轉染PLIN1過表達腺病毒和沉默siRNA，發現PLIN1可促進甘油三酯在脂肪細胞的積累和脂滴的增多增大，同時可以抑制由NF-κB炎癥信號通路引起的炎癥反應。本研究從奶牛腎周獲取脂肪組織，分離得到的脂肪干細胞與其他動物不同部位分離所得的脂肪干細胞具有相似的細胞形態以及生長特性。

脂肪干細胞表面的特異性蛋白尚無明確定論。2006年，國際細胞治療協會宣布脂肪干細胞的表型是CD31-/CD34+/CD45-[20-21]。2013年，國際脂肪應用技術協會宣布新分離的脂肪干細胞表型為CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，而經體外培養的ADSCs表型為CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+[21-22]。本研究測定了犢牛脂肪干細胞Vimentin、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90 6個蛋白。CD34是目前學術界存在廣泛爭議的蛋白，陳猶白等[21]提出體內的、剛分離的和體外培養初期的脂肪干細胞高表達CD34，但經體外長時間培養后，其表達逐漸降低至最后完全消失。Vimentin是主要的中間絲蛋白之一，廣泛存在于各種間充質細胞及中胚層來源的細胞中，本研究測得Vimentin染色呈陽性，說明分離所得的細胞是來源于中胚層的間充質干細胞。而分離的細胞CD34、CD44、CD90呈陽性，CD31、CD45呈陰性，其表型基本符合國際細胞治療協會最新宣布的脂肪干細胞表型，可初步證明分離的細胞是犢牛脂肪干細胞。

脂肪干細胞的多向分化能力多可通過分化為成脂細胞和成骨細胞來鑒定，肖建紅等[23]研究發現，對第5代脂肪干細胞進行成脂誘導分化后，經油紅O染色可見細胞內大量葡萄樣的紅色脂滴；張鑒清等[24]從小鼠附睪分離的脂肪干細胞經體外成脂誘導后，細胞內可見較多圓形被染的小脂滴。李玲慧等[25]從大鼠腹腔內取材，并對第3代脂肪干細胞進行成骨性誘導，28 d后經茜素紅染色陽性，細胞堆積生長，可見橘紅色深染的礦化結節。這與本研結果相似，證明試驗分離的犢牛脂肪干細胞可以經體外誘導定向分化為脂肪細胞和成骨細胞。