表皮松解性掌跖角化病一家系KRT9基因突變檢測

倪曉靜 周乃慧 王建波 李 敏

表皮松解性掌跖角化病(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK，OMIM:144200)是一種少見的常染色體顯性遺傳性皮膚病，由V?rner于1901年首先描述，故又稱V?rner型掌跖角化病[1]。本病主要臨床表現為局限于掌跖部位的彌漫性、斑塊狀、有清晰紅色邊緣的角質增厚，表面光滑，顏色偏黃。常在出生后3個月至1年內發病[2]。Reis等首次將EPPK的致病基因定位在染色體17q12-q21上，隨后在角蛋白9基因(keratin 9 gene，KRT9)中檢測到一點突變R162W，確定該病的致病基因[3,4]。現報道一例EPPK，并分析其KRT9基因的突變情況。

1 先證者資料

患者，女，41歲。掌跖皮膚增厚40余年。患者出生后約4個月掌跖部開始出現彌漫性角化，隨著年齡增加掌跖彌漫性角化過度明顯加重，僅局限于掌跖部位，邊緣清楚，色澤淡黃，表面光滑。夏季較輕，冬季干燥明顯，足底常脫屑、皸裂。體格檢查：一般情況好， 各系統檢査未發現明顯異常。皮膚科檢查：掌跖部可見彌漫性角化增厚組織，淡黃色，邊界清，表面干燥、質硬，雙足底有少量脫屑和皸裂(圖1a、b)。毛發、牙齒、甲及口腔粘膜未見明顯異常。實驗室檢查：足底真菌鏡檢陰性，血、尿、糞常規及肝腎功能未見明顯異常。患者拒絕行組織病理學檢查。

2 家系調查

患者母親有類似癥狀，父親正常，父母非近親結婚。家族三代共有患者6例，男2例，女4例，均為出生后3～6個月發病，皮損類似，均表現為掌跖彌漫性角化過度。目前未發病者子代均正常，發病無性別差異，無隔代遺傳現象，符合常染色體顯性遺傳模式(圖2)。

3 KRT9基因檢測

3.1 實驗方法 在簽署書面知情同意書后，對整個家系14個家庭成員(6例患者，8名正常)進行血樣采集。應用北京Tiangen公司TIANamp Blood基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA。同樣方法提取100名無親緣關系的健康對照個體基因組DNA作為對照。通過因特網(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查取KRT9 mRNA序列，經BLAST比對得到該基因的基因組序列 (http://www.genome.UCSC.edu/)，應用 Primer 3.0設計特異性引物對KRT9所有外顯子及其側翼序列進行PCR擴增。擴增條件：94℃預變性5 min后，94℃變性45s，56℃～60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環。72℃延伸10 min。2%的瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。擴增產物純化后直接在 ABI3730全自動DNA測序儀(美國Applied Biosystems)上進行雙向測序，各測序結果采用BioEdit軟件比對分析結果。用SIFT和Polyphen-2軟件預測c.482A>G (p.Asn161Ser) 突變位點的有害性。

3.2 結果 PCR產物測序結果經BioEdit軟件比對分析后發現，該家系6例患者的KRT9基因第482位堿基腺嘌呤(A)突變為鳥嘌呤(G)，家系中8名表型正常者及100名正常對照中均未發現此突變(圖3a、b)。SIFT軟件對p.Asn161Ser突變的功能預測結果為有害(deleterious)，其score為-4.668。Polyphen-2軟件的預測結果為可能有害(probably damaging)，p.Asn161Ser突變的score為1.00。提示SIFT和Polyphen-2軟件預測p.Asn161Ser突變均為有害變異位點，可能影響其蛋白質功能。

圖1 a：雙手掌彌漫性淡黃色角化增厚組織；b：雙足掌彌漫性淡黃色角化增厚組織，上覆較多鱗屑，局部皸裂圖2 家系圖，箭頭所指為先證者

a：正常人；b：患者，箭頭示c.482A>G(p.Asn161Ser)突變

4 討論

EPPK是一種常染色體顯性遺傳病，均在出生后3個月至1年內發病，通常在3～4歲表現完全，以掌跖部的皮膚彌漫性角化為主要臨床特征。本病通常不累及掌跖部伸側，部分患者伴發指節墊、甲改變(甲板增厚、渾濁)和手指畸形等臨床表現，可伴發癌癥、聽力喪失及心力衰竭等危害嚴重的疾病。本研究中，先證者具有典型的臨床表現，結合其家系符合常染色體顯性遺傳模式，EPPK基本可診斷，基因突變分析進一步明確診斷。

近些年的遺傳及分子學研究表明，EPPK是由編碼角蛋白9的基因KRT9發生突變所致。KRT9是一種Ⅰ型角蛋白，僅表達于掌跖部表皮的棘突層。角蛋白基因的突變常會引起各種表皮和非表皮的細胞脆性問題[5,6]。突變的角蛋白纖維削弱了細胞骨架，當細胞遭受物理創傷時，導致角質形成細胞的結構網絡崩潰。KRT9基因突變熱區位于桿狀功能域lA區前端的15個氨基酸和2B區末端的10～11個氨基酸，這兩個區域是兩段在進化上高度保守的氨基酸序列：螺旋起始基序和螺旋終末基序[7,8]。迄今，在不同的EPPK家系中檢測到至少32種不同的KRT9基因突變位點，其中25種發生在1A區，6種發生在2B區[9-12]。2013年，Fuchs-Telem等[13]報道一新發突變p.[Leu11Val; Leu11_Gln172del]，該突變位點除了涉及1A區，還累及KRT9非螺旋區的頭部，打破了學者們常規認為KRT9基因突變位點通常在1A和2B區域的觀念。KRT9基因1A區的突變p.R163W是EPPK中最常見的突變類型，約占31.71%，在我國的發生頻率約為31.03%[9]。目前EPPK仍沒有明確的基因型-表型相關性分析，可見本病的發病因素或許比人類迄今所了解的更復雜。

本家系中患者的KRT9基因第482位堿基腺嘌呤(A)突變為鳥嘌呤(G)，導致1號外顯子中第161位密碼子由AAT→AGT，即正常的天冬酰胺(Asparagine，Asn)由絲氨酸(Serine，Ser)取代，即c.482A>G(p.Asn161Ser)。此突變位點既往國內有報道[14,15]，當時報道為“KRT9基因第1外顯子第160位密碼子發生AAT→AGT的突變，導致第160位的天門冬氨酸被絲氨酸取代(N160S)”。新版本的KRT9基因序列發表于2005年4月23日，突變R162W更換為R163W[gi:55956898]，故此突變位點最新的標注為c.482A>G(p.Asn161Ser)。此外，既往文中的天門冬氨酸應更改為天冬酰胺。本家系突變位點c.482A>G(p.Asn161Ser)處于桿狀功能域螺旋起始基序，桿狀結構域為α-螺旋二級結構，突變后可能引起氨基酸理化性質的改變，造成角蛋白亞單位受損，從而破壞角蛋白中間絲聚合的穩定性，最終導致本家系患者掌跖角化過度的發生。另外 SIFT和Polyphen-2軟件也同時預測c.482A>G(p.Asn161Ser)突變為有害變異位點，進一步印證該突變可能影響蛋白質功能。此突變位點也為熱點突變，目前所報道的均發生在亞洲國家，日本、韓國及國內均有家系報道[6]。國內報道的家系中患者有伴發指節墊、甲改變和手指畸形等臨床表現[14,15]。本家系患者中均無以上病變，以上病變是否與KRT9基因突變有關及其致病機理如何還有待進一步研究。

總之，EPPK根據其臨床表現結合基因突變分析即可確診，但具體的發病機制尚不明確。目前治療方法有局部對癥治療、口服維A酸類藥物、CO2激光療法及分層皮片移植術等，但療效均不佳，本病理論上仍寄希望于基因治療。目前的病例報道、基因測序及功能研究等進一步為該病的基因診斷、遺傳咨詢和基因治療提供理論基礎。