M1/M2型巨噬細胞在尖銳濕疣皮損中的表達

劉 睿 孫 弦 胡 珍 吳 庭 曹育春 彭才智

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是一種好發于泌尿生殖器皮膚黏膜部位的增生性性傳播疾病，是由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起，常用治療包括CO2激光、液氮冷凍、光動力、藥物等，但其治療后容易復發，是臨床中面臨的一大難題[1]。有研究表明，尖銳濕疣治療后復發的根本原因是HPV感染后營造了局部免疫抑制的微環境，使其逃避了機體免疫系統的清除，進而引起尖銳濕疣的反復發作[2]。在人體皮膚黏膜抗HPV感染的免疫過程中，巨噬細胞發揮了重要作用，它屬于一類髓性的自然免疫細胞，可通過吞噬病毒顆粒、釋放細胞因子等方式抑制病毒感染而產生抗病毒效應。在不同的局部微環境中，巨噬細胞的功能表型可發生不同的極化，其中最常見的兩種極化形式為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞[3]。在腫瘤的相關研究中發現，在腫瘤實體和間質組織中有較多腫瘤相關性巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)，多表現為M2型巨噬細胞樣功能表型，可以促進腫瘤的發生和惡性進展等，不利于腫瘤的預后[4]。臨床上尖銳濕疣皮損組織的生長模式類似腫瘤組織，已經有研究發現[5]，尖銳濕疣組織內有較多的巨噬細胞，而不同表型的巨噬細胞浸潤情況及其對尖銳濕疣復發的影響尚不清楚。本文通過檢測尖銳濕疣組織中誘導型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)+巨噬細胞(M1型)、CD163+巨噬細胞(M2型)的浸潤情況，以探討其對尖銳濕疣免疫逃逸的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料 尖銳濕疣標本取自武漢市第三醫院皮膚科2017年1月至2018年1月的30例門診患者，均經組織病理確診為尖銳濕疣。其中男21例，女9例；年齡16～53歲，平均26.5歲；病程1～6個月。所有患者就診前1個月均未接受任何治療，均無其他皮膚病及系統免疫疾病。對照組15例正常皮膚組織來自色素痣整形手術切除后遺棄的正常皮膚組織。CA標本和正常組織的獲取，均已得到患者的知情同意。

1.2 主要試劑 即用型鼠抗人CD163單克隆抗體、即用型鼠抗人iNOS單克隆抗體、即用型免疫組化Elivision-plus 試劑盒(鼠|兔)、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 標本處理及免疫組織化學染色 所有標本獲得后在10%中性福爾馬林溶液中固定24小時，石蠟包埋，4 μm連續切片，行免疫組織化學染色。石蠟切片脫蠟，水化，檸檬酸高壓修復抗原，按試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。用已知的陽性片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 CD163、iNOS主要表達于巨噬細胞的細胞膜或細胞質，以細胞質或細胞膜出現棕黃色或黃褐色顆粒為陽性細胞。首先低倍鏡(×100)觀察每張切片的陽性細胞密集區，然后每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，計數陽性細胞，取平均值，15天后再用上述方法計數陽性細胞，兩次結果的平均值作為最后統計結果。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行數據分析，實驗結果以均數±標準差表示。采用t檢驗、Pearson線性相關分析，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 M1/M2型巨噬細胞在尖銳濕疣和正常組織中浸潤情況 iNOS+M1型巨噬細胞在CA皮損組織中數量為(6.16±3.32)/HP，正常組織中數量為(6.76±0.87)/HP(圖1)；CD163+M2型巨噬細胞在CA皮損組織中數量為(22.30±6.27)/HP，正常組織中數量為(9.81±4.23)/HP(圖2)。在CA皮損組織中，iNOS+M1型巨噬細胞的浸潤與正常組織相比，差異無統計學意義(P>0.05)；而CD163+M2型巨噬細胞的浸潤與正常組織相比，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 iNOS+M1型巨噬細胞在CA組織(1a)和正常組織(1b)中的浸潤(SP，×400)圖2 CD163+M2型巨噬細胞在CA組織(2a)和正常組織(2b)中的浸潤(SP，×400)

2.2 M1/M2型巨噬細胞在尖銳濕疣組織浸潤的相關性 在CA組織中，CD163+M2型巨噬細胞浸潤明顯增多的同時，iNOS+M1型巨噬細胞的浸潤減少，經Pearson統計學處理，二者呈負相關性(r=-0.905，P<0.05)(圖3)。

圖3 iNOS+M1型和CD163+M2型巨噬細胞在CA組織中的浸潤呈負相關(直線為計算出的回歸直線)

3 討論

巨噬細胞是機體一類重要的髓性天然免疫細胞，主要通過吞噬作用及分泌細胞因子、致炎因子、活性氧化物等，參與機體的天然免疫和獲得性免疫過程。巨噬細胞的可塑性和異質性很強，效仿Th1/Th2細胞的分型方式，可將巨噬細胞極端的分為兩大類：經典活化的M1型巨噬細胞和選擇性活化的M2型巨噬細胞[6]。在微環境中干擾素(interferon，IFN)-γ)或/和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)的誘導刺激下，巨噬細胞可極化為經典活化的M1型，其主要參與Th1細胞免疫反應，發揮針對胞內微生物的免疫清除、抗腫瘤作用及宿主免疫功能等；而在微環境中白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-13或IL-10、糖皮質激素等的誘導刺激下，巨噬細胞可極化為選擇性活化的M2型，其在機體腫瘤生長及免疫調節方面發揮重要作用，參與腫瘤的生長、侵襲，促進血管、淋巴管生成以及抑制T細胞和自然殺傷細胞的免疫活性[6，7]。M1型巨噬細胞高表達HLA-DR、iNOS等，而M2型巨噬細胞高表達清道夫(如CD163)、甘露糖(如CD206)等表面受體以及精氨酸酶(arginase，ARG)1，低表達iNOS酶[7，8]。其中，iNOS酶主要由M1型巨噬細胞合成分泌，催化L-精氨酸產生NO和L-瓜氨酸，NO參與機體炎癥反應、殺滅微生物及抗腫瘤過程，可作為M1型巨噬細胞的標記物[8]。CD163屬于富含半胱氨酸的清道夫受體膜蛋白家族，主要表達于單核巨噬細胞系的表面，可以結合血紅蛋白-珠蛋白復合物，從而將血紅蛋白攝入單核-巨噬細胞中參與代謝，多被用來標記M2型巨噬細胞[8，9]。

本研究選用iNOS作為M1型巨噬細胞的標記，CD163作為M2型巨噬細胞的標記，進行免疫組織化學染色。免疫組織化學結果顯示，尖銳濕疣皮損組織中M1型巨噬細胞的浸潤數量較正常組織無明顯差異，而M2型巨噬細胞數量明顯多于正常組織，且M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞的浸潤呈負相關，說明隨著M2型巨噬細胞的浸潤增多，M1型巨噬細胞浸潤隨之減少。該研究結果初步證實了尖銳濕疣皮損組織中有較多的M2型巨噬細胞浸潤，即M2型巨噬細胞在尖銳濕疣局部免疫中處于優勢，結合M2型巨噬細胞具有負向免疫調節作用，故其可能在尖銳濕疣皮損組織局部免疫逃逸過程中發揮了重要作用。而對于尖銳濕疣組織中的巨噬細胞如何轉變為M2型巨噬細胞的機制，目前還不完全清楚。已經有研究證實，CD4+CD25+調節性T細胞可以影響巨噬細胞表型及功能的變化[10]，而尖銳濕疣皮損組織中存在較多的CD4+CD25+調節性T細胞[5]。故我們推測尖銳濕疣皮損中的CD4+CD25+調節性T細胞可能參與了巨噬細胞表型轉化過程，這需要進一步研究去證實。