同源四倍體矮牽牛的核型分析及有絲分裂觀察

魏 躍， 王 棟， 王媛花， 賈思振， 顏志明， 徐婷婷

(江蘇農林職業技術學院，江蘇 鎮江 212400)

矮牽牛(PetuniahybridaVilm.)為茄科矮牽牛屬草本花卉，夏秋季開花，色彩豐富，花期長，具有較高觀賞價值，適用于花壇、花境及自然式布置，在世界各地廣泛栽培，被喻為“世界花壇花卉之王”。魏躍等[1]曾利用秋水仙素處理二倍體矮牽牛(2n=2x=14)，獲得同源四倍體(2n=4x=28)新種質，其生長勢強于二倍體，株高、莖粗、花瓣直徑等性狀變大，觀賞性增加，顯示多倍體矮牽牛具有較好的應用前景。近年來國內也有一些有關矮牽牛的細胞學研究，蔡華等[2]曾利用根尖進行核型分析，并證實二倍體矮牽牛染色體數目為2n=14，筆者等[3-4]也對二、四倍體矮牽牛花粉母細胞減數分裂過程進行過細胞學觀察，但有關矮牽牛同源四倍體核型分析及有絲分裂等相關細胞學研究還未見報道。為此，筆者等對四倍體矮牽牛的核型及有絲分裂進行觀察研究，確認其核型和有絲分裂的特異性，為同源多倍體細胞分類、染色體工程等方面研究提供借鑒。另外研究人員對觀賞花卉進行核型研究時大多都以根尖、芽為材料[5-6]，本試驗采用幼嫩柱頭進行核型分析，旨在為觀賞花卉的細胞學研究提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料矮牽牛四倍體品系09-5，由江蘇農林職業技術學院花卉課題組提供，系利用秋水仙素誘導二倍體品種夢幻(購自浙江虹越花卉有限公司)經5～6代選育而成。

1.2 方法

雌蕊染色體制備參考張紅梅等[7]方法進行，于夏季晴天早晨8∶00-10∶00點，取長度0.5～1 cm的幼小花蕾，置于0.002 mol/L 8-羥基喹啉水溶液中預處理3 h，蒸餾水沖洗3次，卡諾固定液(無水乙醇與冰醋酸體積比為3∶1)固定24 h，蒸餾水沖洗3次，0.075 mol/L氯化鉀滴滲1 h，蒸餾水沖洗3次，1 mol/L HCl 60℃水浴解離6 min，蒸餾水沖洗3次，分別切取柱頭、花柱和子房部位，用質量濃度為1%的醋酸洋紅染色液充分染色后常規壓片。觀察3種部位的切片各30張，統計有絲分裂中期分裂相比率(中期細胞數目/觀察細胞總數目×100%)。

核型分析：從四倍體材料中選5張中期分裂相良好的照片，采用Ikaros染色體圖像分析軟件進行染色體核型配對分析，并參照李懋學和陳瑞陽等[8-9]的植物核型分析標準進行分析測量，獲得染色體參數，按STEBBINS[10]的分類標準進行核型分類。

2 結果與分析

2.1 雌蕊染色體觀察最佳部位的篩選

在物鏡(40×)同一視野下，柱頭平均中期分裂相比率為3.8%，花柱和子房分別為1.1%和1.9%。表明四倍體矮牽牛雌蕊中柱頭細胞處于有絲分裂中期的比率最高，適宜用于進行染色體觀察與分析。

2.2 四倍體矮牽牛核型分析

從圖1和表1可知，有絲分裂中期四倍體矮牽牛1～7號染色體絕對長度的變化范圍在4.83～7.62 μm，相對長度的變化范圍在11.3%～17.82%，相對長度系數(某染色體長度/染色體組的平均長度)[11]在0.79～1.25，其中1～3號染色體為中長染色體(M1)，4～7號染色體為中短染色體(M2)。臂比(長臂/短臂)變化范圍為1.04～2.43，著絲粒指數為29.12%～49.04%，1、4、6、7號染色體為中部著絲粒染色體(m)，2、3、5號為亞中部著絲粒染色體(sm)，隨體在2號染色體。

四倍體矮牽牛終變期核型公式為K(2n)=4x=28=16m+12 sm(4SAT)，染色體相對長度組成為2n=28=12M1+16M2。染色體長度比(最長/最短)比值為1.58，臂比大于2的染色體比例為28.57%，不對稱系數為60.23%，為基本對稱類型，按照STEBBINS[10]核型分類標準，矮牽牛核型分類為2A型屬于較原始類型。

圖1 同源四倍體矮牽牛染色體有絲分裂中期分裂相、核型及核型模式

Fig.1 Mitotic phase, chromosome karyotype and karyotypic pattern of autotetraploidP.hybridachromosomes at mitosis metaphase

表1 同源四倍體矮牽牛染色體的核型參數

注：*為具隨體的染色體.

Note:*, the chromosome with satellites.

2.3 有絲分裂的異常現象

同源四倍體矮牽牛雌蕊柱頭體細胞有絲分裂過程中存在少量異常現象：在間期有微核仁出現(圖2-1)，細胞發生頻率為3.17%；有絲分裂早中期姐妹染色單體部分交叉在一起呈鏈鎖狀發生染色單體交換(sister chromatid exchanges,SCE)(圖2-2) 發生頻率為0.8%；同源體細胞染色體配對成二價體(圖2-3,2-4) 發生頻率為3.7%；中期染色體排列在赤道板外(圖2-5)、染色體丟失在細胞質中(圖2-6)、后期出現落后染色體(圖2-7)和染色體橋(圖2-8 )合計發生頻率為6.5%，此外還有中期和后期染色體出現凝集粘合(圖2-9,2-10) 發生頻率為2.9%。四倍體矮牽牛染色體數目應為2n=28，但少數細胞中出現2n=20(圖2-11)和2n=24 (圖2-12)非整倍體現象，發生頻率約為1.7%。

注：1為微核仁，2為姐妹染色單體交換(箭頭示)，3、4為體細胞同源染色體配對，5為赤道板外染色體，6為丟失染色體，為7落后染色體，8為染色體橋，9、10為凝集粘合，11、12為非整倍體。

Note:1.Micronucleolus; 2.Sister chromatid exchange; 3 and 4.Homoeologous pairing in somatic cell;5.Chromosomes outside the metaphase plate;6.Lost chromosome;7.Laggard chromosomes;8.Chromosome bridge;9 and 10.Chromosome condensation and bonding;11 and 12.Aneuploid.

圖2同源四倍體矮牽牛異常有絲分裂及非整倍體(×1300)

Fig.2 Abnormal mitosis and aneuploid of autotetraploidP.hybridachromosomes (×1300)

3 結論與討論

根尖是核型分析最常用的材料但對種子需求量較大，對結籽率低種子較少的作物不適用，且需要進行發芽培養，過程繁瑣試驗周期長。在理論上凡有細胞旺盛生長有絲分裂活躍的分生器官、組織都可以進行染色體觀察，如陳勁楓等[12]用卷須代替根尖材料對黃瓜、菜豆和葡萄的染色體進行核型分析，蔡華等[13]利用新生子葉對牡丹進行核型分析，張紅梅等[7]利用青花菜雌蕊子房進行染色體核型分析。本試驗以幼嫩柱頭為材料對四倍體矮牽牛進行核型分析，由于矮牽牛開花期較長，與根尖相比試驗材料較多、取材方便且無需材料的培養準備，縮短了試驗周期，簡化了流程。染色體進行核型分析時取樣大小也很重要，取材適宜其細胞分裂指數往往較高、中期分裂相也多。本試驗同源四倍體矮牽牛幼小花蕾長度為0.5～1 cm時其中柱頭直徑為0.7～1.5 mm，此時柱頭中有較多細胞處于有絲分裂旺盛期，中期分裂相較多,適合進行染色體研究。

核仁是真核生物細胞核特有的結構，并隨著細胞周期發生分離和聚合。RISSO-PASCOTTO[14]在臂形草減數分裂前期I以外的各時期均觀察到微核仁，認為微核仁是由前期的大核仁裂解而來，是基因發生自然突變所致。曹清河等[15]則認為細胞分裂周期中前核仁體由于無法聚合成大核仁而以游離狀態存在于細胞中可形成微核仁。李悅有等[16]認為微核仁存在狀態與細胞中蛋白質合成的旺盛程度密切相關。本試驗結果顯示，四倍體矮牽牛微核仁的發生頻率平均為3.17%，高于二倍體的發生頻率(0.92%)，這可能與多倍體化后蛋白質合成旺盛程度增加相關。微核仁結構的存在有著復雜的生物學機制，其機理有待進一步探討。

姐妹染色單體交換(SCE)是姐妹染色單體在相同位置發生等位片段交換，如發生不對等交換會導致基因擴增或丟失，SCE頻率增加被認為是細胞環境中高濃度有害物質增加導致的，易導致染色體畸變[17]。儀慧蘭等[18]使用NaCl溶液培養大麥幼苗導致根尖細胞有絲分裂指數下降，SCE頻率增高且誘發有絲分裂染色體行為異常。本試驗中觀察到姐妹染色單體大片段多位點單體交換異常現象，可能與加倍后細胞內原有結構和功能改變, 導致DNA修復錯誤或抑制修復頻率增加從而產生SCE[17]。

四倍體矮牽牛有絲分裂過程存在少量染色體凝集粘合、同源染色體配對、染色體丟失、赤道板外染色體、落后染色體、非整倍體等異常現象，而其中丟失和落后染色體、染色體橋可能是導致非整倍體產生的重要原因[19]。對同源四倍體異常有絲分裂的原因，張紅梅等[7]認為可能是由于四倍體染色體加倍打破了二倍體中各種固有的平衡，造成內源激素不協調和生理生化過程不正常而造成的；STEBBINS等[10]認為同源四倍體有絲分裂不正常分離與染色體加倍造成特定基因位點純合、隱性基因控制性狀有關。四倍體矮牽牛體細胞有絲分裂產生異常現象的機理可能與上述因素相關但具體機理尚有待進一步探究。