番茄不同截短U3啟動子的克隆及功能分析

蒲 艷，劉曉東，阿爾祖古麗·塔什，魏 倩，劉 超

(新疆農業大學 農學院，新疆農業大學農業生物技術重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

番茄屬于茄科，在2012年完成了番茄全基因組測序，其具有較完整的遺傳轉化體系，這使得番茄成為一個可以很好地運用于科學研究的模式之物。然而，由于缺乏有效的突變體遺傳材料，筆者對這些基因或DNA片段的作用或功能卻知之甚少。為了從大量的數據中更好地了解基因的功能，迫切需要新的基因編輯技術來滿足日益增長的科研需求；同時，通過基因編輯技術培育具有優良性狀的農作物可以在一定程度上解決農作物的轉基因問題。

近幾年，基因編輯技術成為生物學研究的熱點，其主要包括鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)[1]、TALEN核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs)[2]、CRISPR/Cas(規律成簇間隔短回文重復序列clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)[3]3種技術體系。而Type Ⅱ的CRISPR/Cas9系統作為一項新型的基因組編輯技術，是繼ZFNs及TALEN后在作物基因功能組學研究領域新進的一個基因打靶系統，其載體構建簡單，特異性高，據報道已成功地在許多不同的物種中實現了基因的定點編輯[4-12]。CRISPR/Cas9系統中，行使向導功能的是由tracrRNA與crRNA分子間形成的RNA二元復合體改造的單鏈RNA嵌合體sgRNA，其招募Cas9核酸酶對靶位點進行切割，切割位點于PAM位點上游3～4個堿基處，PAM序列為緊鄰靶位點的5′-NGG-3′。而U3啟動子是CRISPR/Cas9系統中重要的元件之一，能驅動sgRNA的轉錄。在植物中，U3和U6啟動子由RNA聚合酶Ⅲ轉錄，其具有非常明確的轉錄起始位點，并且轉錄活性較高，U3啟動子轉錄起始位點為A，U6啟動子轉錄起始位點為G，明確的轉錄起始位點在CRISPR/Cas9系統靶序列的設計及構建更加精確[13-14]，同時可以保證不會有多余的序列被轉錄出來，在sgRNA靶向基因組模板時，也可以提高特異性，從而減少脫靶的現象[15-16]，如Shan等[12]利用水稻內源U3啟動子驅動sgRNA轉錄，成功在水稻中實現了PDS和DEP1基因的編輯。Liang等[9]克隆了玉米U3啟動子，并成功在玉米原生質體中實現了內源基因ZmIPK的編輯。雖然目前有關U3啟動子的CRISPR/Cas9系統在許多物種中已經得到了應用，但相同的U3啟動子在同緣關系較遠的物種中不一定適用，并且目前未見適用于番茄的內源U3啟動子的報道，篩選出在番茄葉片中有功能活性的U3啟動子很有必要。USE和TATA框是真核生物中U3啟動子發揮轉錄功能的2個重要元件，本研究通過對候選的3種U3啟動子與擬南芥U3啟動子序列比對，發現番茄的U3啟動子內也含有非常保守的2個元件，但它們是否均具有轉錄活性還需進一步驗證。

本研究從番茄中蔬四號中克隆了3種6個不同長度的U3啟動子，再利用農桿菌轉化法侵染番茄葉片，通過GUS染色對其轉錄活性進行分析，篩選出活性較高的U3啟動子，旨在為構建番茄CRISPR/Cas9基因編輯載體提供更多高效的內源啟動子。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用中蔬四號番茄品種、農桿菌GV3101均由新疆農業大學農學院實驗室保存。限制性內切酶購于Thermo公司；克隆感受態細胞Trans5α、Blunt Zero平端載體、T4DNA連接酶、1 kb Plus DNA Ladder、植物基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒等均購自北京全式金生物技術公司；PhusionDNA聚合酶購于北京NEB公司；引物合成和測序由上海杰李生物科技有限公司完成。

1.2 番茄SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動子的克隆

將中蔬四號番茄品種播種于含蛭石和營養土的土壤中，取生長21～28 d番茄幼苗葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取番茄基因組DNA，用保守的U3 RNA序列在番茄基因組數據庫中搜索候選U3 RNA對應的U3啟動子序列。本研究采用2輪PCR的方法，以番茄基因組DNA為模板設計引物(表1)，第1輪PCR擴增產物為SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動子全長，用PhusionDNA 聚合酶進行擴增，反應程序為94 ℃ 4 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，35個循環；72 ℃ 8 min。反應體系為5×Phusion Buffer 4 μL；2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL；ddH2O 11 μL；上下游引物各1 μL；Phusion超保真DNA 聚合酶0.4 μL；DNA模板1 μL；共20 μL體系。

第2輪擴增的受體質粒為GhU6-5P2::GUS，供體質粒為SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動子進行Transfer PCR[17]，根據第1輪測序正確的SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動子序列和GhU6-5P2::GUS載體序列分別設計了2對引物(表1)。使用超保真DNA 聚合酶進行擴增，反應程序為94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，13個循環；94 ℃ 30 s，67 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，20個循環；72 ℃ 8 min。反應體系為5×Phusion Buffer 10 μL；2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL；上下游引物各1 μL；供體質粒和受體質粒模板各1 μL；ddH2O 32.7 μL；Phusion超保真DNA 聚合酶0.8 μL；共50 μL體系。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析，對分析正確的PCR產物用DpnⅠ在37 ℃進行酶切處理3 h，取酶切產物10 μL轉化Trans5α感受態細胞，用BglⅡ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-1P重組質粒，XhoⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-3P重組質粒，NsiⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-4P重組質粒，酶切鑒定后選取正確的質粒進行測序，測序正確的質粒命名為T-SlU3-Ps。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

注：下劃線部分為受體質粒堿基序列。

Note：Underlined for the acceptor plasmid partial base sequence.

1.3 SlU3啟動子序列分析

運用 DNAMAN 軟件對候選的番茄U3啟動子與擬南芥U3啟動子進行序列比對，對候選的U3啟動子內功能元件進行分析。

1.4 不同截短SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300融合表達載體的構建

用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切植物表達載體 pCAM-BIA 1300及SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P后分別回收目標片段并用T4連接酶連接、轉化后對重組質粒進行酶切鑒定，鑒定正確的質粒命名為SlU3∷GUS-sgRNA-P1300，轉入農桿菌感受態細胞GV3101后，于28 ℃倒置培養2 d，挑取陽性克隆于LB培養基中(含 Rif 25μg/mL和Kan 50μg/mL)培養至對數生長期。不同SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300 融合表達載體示意圖如圖1所示。

1.5 農桿菌介導法轉染番茄葉片

將構建成功的不同SlU3-P∷GUS-P1300以及陽性對照P1301和陰性對照pCAMBIA1300農桿菌，按照1∶100比例接種于LB培養基(含50 μg/mL Kan和25 μg/mL Rif)中180 r/min，28 ℃至菌液OD600=1時，分別吸取菌液到5 mL LB培養基(含50 μg/mL Kan和25 μg/mL Rif)中，每個菌液的OD值相同后，再次28 ℃, 180 r/min至所有菌液的OD600=1.5，12 000 r/min離心5 min收集菌體于重懸Buffer(50 mmol/L MgCl2、200 mmol/L MES、20 mmol/L乙酰丁香酮)至1 mL，室溫放置3 h后分別注射到生長21 d的番茄子葉中，最后進行過夜暗培養。

圖1 不同截短SlU3-Ps啟動子驅動報告基因GUS的融合表達載體構建Fig.1 Construction of GUS reporter gene fusion expression vector driven by different truncated SlU3-Ps promoter

1.6 不同截短SlU3-Ps∷GUS在番茄葉片中的瞬時表達分析

剪下暗培養過夜后的番茄葉片浸泡在150 μLGUS染液中(0.5 mol/L EDTA, pH值8.0；0.5 mol/L磷酸緩沖液, pH值7.0；20 mmol/L X-Gluc；10% Triton X-100),-0.05 MPa下抽真空30 min。抽完真空后置于37 ℃，180 r/min振蕩染色6～7 h后100 r/min離心1 min吸取上清GUS染液。為徹底去除殘留的GUS染液，用蒸餾水漂洗染色后的葉片4～5次，100 r/min 離心1 min。染色完成后加入300 μL無水乙醇進行脫色處理，每3～4 h更換一次脫色液，直至葉片呈透明狀。

2 結果與分析

2.1 第1輪SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動子擴增產物鑒定

從中蔬四號番茄中成功擴增出SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動子片段，長度分別為1 156，1 114，1 147 bp(圖2)。用BglⅡ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-1P重組質粒，XhoⅠ和NotⅠ 雙酶切鑒定SlU3-3P重組質粒，NsiⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-4P重組質粒，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測結果正確，最終測序比對后為預期的SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動子。

M.2 kb PlusⅡ標準分子量；1.SlU3-1P,1 156 bp；2.SlU3-3P,1 114 bp；3.SlU3-4P,1 147 bp。M.2 kb PlusⅡDNA Marker; 1.SlU3-1P,1 156 bp; 2.SlU3-3P,1 114 bp; 3.SlU3-4P,1 147 bp.

2.2 Transfer PCR擴增產物鑒定

以測序正確的第1輪SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P為供體質粒，GhU6-5P2∷GUS受體質粒進行Transfer PCR，其目的是將受體質粒GhU6-5P2∷GUS啟動子片段置換為SlU3∷GUS-sgRNA片段。圖3為成功克隆的不同截短的T-SlU3-1P4f、T-SlU3-1P5f、T-SlU3-3P4f、T-SlU3-3P5f、T-SlU3-4P4f、T-SlU3-4P5f啟動子電泳圖，其片段大小依次是489，318，450，248，457，248 bp。用MfeⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切鑒定各截短啟動子質粒，電泳后發現，酶切結果與預測片段大小一致，測序比對后為預期截短的T-SlU3Ps啟動子(圖3)。

A、B、C．Transfer PCR擴增；M. 2 kb PlusⅡ DNA標準分子量；A: 1.T-SlU3-1P4f；2.T-SlU3-1P5f; B: 1.T-SlU3-3P4f；2.T-SlU3-3P5f；C: 1.T-SlU3-4P4f；2.T-SlU3-4P5f；圖中小片段為第1階段擴增的SlU3啟動子，大片段為第2階段擴增產物。D.酶切鑒定: 1.T-SlU3-1P5；2.T-SlU3-3P5；3.T-SlU3-3P4；4.T-SlU3-4P5；5.T-SlU3-4P4；6.T-SlU3-1P4.

A,B,C.Transfer PCR amplificaton;M. 2 kb PlusⅡDNA Marker; A: 1.T-SlU3-1P4f;2.T-SlU3-1P5f;B:1.T-SlU3-3P4f;2.T-SlU3-3P5f; C:1.T-SlU3-4P4f;2.T-SlU3-4P5f;The small fragment in the figure is the first-stage amplifiedSlU3 promoter, and the large fragment is the second-stage amplification product.D. Identification: 1.T-SlU3-1P5; 2.T-SlU3-3P5; 3.T-SlU3-3P4;4.T-SlU3-4P5; 5.T-SlU3-4P4; 6.T-SlU3-1P4.

圖3三種番茄U3啟動子的TransferPCR擴增及酶切鑒定
Fig.3TransferPCRamplificationandidentificationofthreekindsoftomatoU3promoters

2.3 SlU3啟動子序列分析

對本研究已克隆的3種番茄U3啟動子和擬南芥U3啟動子進行序列比對，發現番茄U3啟動子區域包含RNA聚合酶Ⅲ轉錄所需要的元件，位于-30 bp的TATA框和位于-60 bp的USE元件5′-RTCCCA CATCG-3′，圖中方框為USE和TATA框，黑色箭頭處為U3 RNA的起始位點(圖4)。

圖4 SlU3啟動子序列分析Fig.4 Sequence analysis of SlU3 promoters

2.4 不同截短SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300融合表達載體構建

將正確的番茄不同截短SlU3Ps∷GUS-sgRNA的重組質粒片段連入植物表達載體pCAMBIA1300，用KpnⅠ和HindⅢ分別對不同SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300重組質粒進行酶切鑒定，酶切的結果和預測片段大小一致(圖5)。

A: M.1 kb DNA標準分子量；1.SlU3-1P4∷GUS-sgRNA-P1300；2.SlU3-3P4∷GUS-sgRNA-P1300；3.SlU3-1P5∷GUS-sgRNA-P1300；4.SlU3-3P5∷GUS-sgRNA-P1300；B：M.2 kb plusⅡ標準分子量；1.SlU3-4P4∷GUS-sgRNA-P1300；2.SlU3-4P5∷GUS-sgRNA-P1300。A：M.1 kb DNA Marker;1.SlU3-1P4∷GUS-sgRNA-P1300; 2.SlU3-3P4∷GUS-sgRNA-P1300; 3.SlU3-1P5∷GUS-sgRNA-P1300;4.SlU3-3P5∷GUS-sgRNA-P1300;B：M.2 kb plusⅡ DNA Marker; 1.SlU3-4P4∷GUS-sgRNA-P1300; 2.SlU3-4P5∷GUS-sgRNA-P1300.

2.5 不同截短SlU3啟動子功能分析

將構建好的不同截短SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300，陰性對照pCAMBIA1300及陽性對照pCAMBIA1301通過農桿菌介導法注射番茄葉片。通過GUS組織化學染色分析結果顯示，侵染成功后的番茄葉片均被染成藍色，其表明已克隆的6種SlU3啟動子均能驅動報告基因GUS的表達，但其表達水平存在一定差異(圖6)。

圖6 番茄不同截短SlU3啟動子驅動GUS在番茄葉片中的瞬時表達Fig.6 Transient expression of GUS in tomato leaves driven by different truncated SlU3 promoters in tomato

3 討論

Ⅱ型CRISPR/Cas9基因組編輯系統作為一項全新的基因組定點修飾技術，近幾年已被成功地應用于不同植物中，能實現在基因組特定位點的修飾。在基因組編輯的過程中，sgRNA能夠靶向結合到目的基因位點，與CRISPR/Cas9系統的特異性相關[18]。其中U3啟動子是重要組成成分之一，被廣泛用于驅動sgRNA的轉錄。U3啟動子具有非常明確的轉錄起始位點(A)且序列較短，其在生物體內驅動的U3 snRNA序列非常保守。依據這些信息U3啟動子可以被精確的克隆。在真核生物體內存在多種U3啟動子，每個啟動子是否均具有轉錄活性并不清楚。雖然有關U3啟動子的CRISPR/Cas9系統已在許多物種中得到了應用，但同樣的U3啟動子在同緣關系較遠的物種中不一定適用[19]，并且目前番茄內源U3啟動子的研究還未見報道，因此，篩選出在番茄中具有功能活性的U3啟動子很有必要。另外,雖然劉曉東課題組已克隆了番茄的U6啟動子，并且利用該啟動子將番茄內源基因成功地實現了編輯，建立了番茄的CRISPR/Cas9基因組編輯技術體系。但由于研究的需要，如研究一個基因家族的功能、多基因控制的復雜數量性狀的研究、單個基因多位點編輯以及長基因片段的刪除，都需要克隆出更多U3或U6啟動子，用于構建多位點基因編輯載體。如擬南芥PYL和水稻FTL基因家族成員的多基因敲除，都使用了植物內源多種U3和U6啟動子[16]。

番茄中至少含有4個U3啟動子，本課題組克隆的3個U3啟動子，將它們和擬南芥U3啟動子進行序列比對分析，發現番茄U3啟動子區域包含RNA聚合酶Ⅲ轉錄所需要的USE元件和TATA框[20]，且這2個元件的序列非常保守、它們之間的距離也比較固定，則推測番茄U3啟動子也同樣具有轉錄活性。為了方便構建CRISPR/Cas9基因組編輯載體，所用的U3啟動子對其轉錄活性和長度上都有很高的要求，因此，有必要克隆長度適宜且活性較高的番茄U3啟動子。本研究通過番茄不同U3啟動子驅動GUS報告基因，并通過農桿菌介導法瞬時轉化番茄葉片來驗證其功能活性。通過GUS組織化學染色分析結果顯示，侵染成功后的番茄葉片均被染成藍色，表明克隆的6種U3啟動子均能驅動報告基因GUS的表達，都具有轉錄活性，當這3種啟動子截短到300 bp左右，甚至是250 bp以內的長度時，仍然能驅動報告基因GUS的表達。這顯示出番茄的U3啟動子也相對較短，與在其他作物中克隆的U3啟動子特點相同[21]。這些啟動子進一步截短后是否還具有轉錄活性，為了構建多位點基因編輯載體，也需要在后續的工作中對進一步截短的啟動子的功能進行研究。本研究克隆的啟動子可為后期在番茄中建立高效的CRISPR/Cas9基因組編輯載體提供更多適用于驅動sgRNA的啟動子。