CPPU處理獼猴桃常溫貯藏過程中果實糖含量相關基因的表達分析

郭琳琳，羅 靜，龐榮麗，王瑞萍，黃玉南，喬成奎，李 君，龐 濤，謝漢忠

(中國農業科學院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009)

我國獼猴桃資源豐富，自然分布有52個種。獼猴桃果實維生素C含量較高，且富含多種礦物質和膳食纖維，具有極高的營養和保健價值，被譽為“水果之王”。獼猴桃是典型的呼吸躍變型果實，需經過貯藏使其完成后熟過程，因此，貯藏能力是影響其商品價值的重要因素之一。影響獼猴桃貯藏品質的因素除了低溫、氣調貯藏、冷鏈運輸等采后環節外，最主要的影響因素是采前環節，包括品種、砧木等遺傳因素、氣候條件、栽培管理水平、病蟲害發生情況等，而CPPU(N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲)的施用與否也與其貯藏品質有關[1-2]。

CPPU是一種具細胞分裂素活性的植物生長調節劑，能顯著促進細胞分裂和增長，在葡萄、草莓、西瓜、梨等果品生產中使用普遍，表現出極大的促進果實生長、增加單果質量的作用[3]。隨著CPPU施用的普及，研究者發現它還能影響果實在成熟時的營養成分，如果實的糖、酸等含量[4-6]。在獼猴桃果實的應用中，CPPU能改善果實碳水化合物的代謝，增加生長期可溶性糖和淀粉從而改善果實品質[7]；花后噴施5 mg/L CPPU使獼猴桃果實單果質量增加的同時，還能增加果實可溶性固形物和總糖的含量，而20 mg/L CPPU處理雖能較好地增加果實單果質量，但果實風味品質變差[8-9]。也有研究者認為，在獼猴桃上施用CPPU能同時顯著降低可溶性固形物和可滴定酸的含量[10]。但目前關于 CPPU 處理影響獼猴桃采后貯藏期間糖含量的機理尚未得到闡釋。為了探究CPPU處理對獼猴桃果實品質影響的分子機制，本研究在盛花后20 d，采用20 mg/L的CPPU處理徐香獼猴桃(Actinidiadeliciosacv. Xuxiang)，成熟后采集果實并在常溫條件下貯藏2，4，6，8 d，分別測定果實的糖、酸及轉錄組數據，對轉錄組測序結果進行組裝和注釋，并鑒定與糖含量變化相關的候選基因。旨在為鑒定獼猴桃果實貯藏過程相關的基因提供有用資源，并為探究通過分子手段抑制CPPU處理果實品質下降的可行性提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年4月在獼猴桃主產區河南省西峽縣商品果園內進行，以清水為對照，用20 mg/L的CPPU處理徐香獼猴桃幼果。9月，采摘成熟、大小一致、無病蟲害的獼猴桃果實，迅速運至實驗室，置于溫度25 ℃、濕度60%左右的條件下常溫貯藏。分別于采后2，4，6，8 d取6～8個果實，去皮，取果肉混合至液氮冷凍后-80 ℃保存，供糖、酸含量測定及RNA提取。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 可溶性固形物的測定 參照農業行業標準(NY/T 2637-2014)《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定折射儀法》[11]。

1.2.2 可溶性總糖的測定 采用菲林試劑滴定法。果肉勻漿后稱取20 g，用水洗入250 mL的容量瓶中，加鹽酸3.5 mL，放入80 ℃水浴中15 min，冷卻后調pH值至中性，定容至250 mL，過濾液即為總糖提取液，用菲林試劑測定總糖含量(以葡萄糖計)。

1.2.3 可滴定酸含量的測定 參照國標(GB/T 12456-2008)《食品中總酸的測定》[12]。

1.3 轉錄組測序

利用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司)提取果肉RNA，加DNaseⅠ(TaKaRa)去除DNA，利用瓊脂糖電泳檢測RNA的純度后，利用Ist Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)對RNA進行反轉錄合成cDNA。

利用單鏈cDNA、dNTPs、RNase H和DNA 聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA，之后添加接頭，純化并構建測序文庫，在北京百邁客生物科技有限公司的HiSeq 2500(Illumina，San Diego，CA，USA)上進行測序。測序結果去除接頭和低質量序列，利用TopHat 2[13]軟件將序列比對至參考基因組[14]，基因表達量的計算采用FPKM(Fragments per kb per million reads)值表示。

1.4 目標基因的GO注釋和KEGG分析

GO(Gene Ontology)注釋采用Blast2GO軟件[15]，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)采用NCBI的Blastall程序進行通路分析。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃貯藏過程中糖、酸含量的變化

貯藏過程中，獼猴桃果實可溶性固形物、可滴定酸和可溶性糖含量的變化情況如圖1所示。

從圖1可以看出，獼猴桃果實在常溫貯藏過程中，對照和CPPU處理果實的可溶性固形物和可溶性糖含量變化與貯藏天數成正比，可滴定酸含量變化趨勢相反。對照的果實可溶性固形物比同時期CPPU處理明顯提高，貯藏第4天時提高比例最高，達20%，其次是貯藏第6天，提高比例為17%，且差異顯著(P<0.05)。對照的果實可溶性糖含量高于同期CPPU的處理，貯藏第6天時二者差異顯著(P<0.05)。而對照和CPPU處理的可滴定酸含量隨貯藏時間的變化差異不顯著(P>0.05)，可見，可溶性糖含量的增加是可溶性固形物含量上升的主要原因。結果表明，施用CPPU降低了獼猴桃果實可溶性固形物和可溶性糖的含量。

圖中不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。圖4同。Different lowercase letters in the figure indicate significant differences of different treatments(P<0.05).The same as Fig.4.

2.2 糖代謝相關基因的篩選

轉錄組測序結果參考Luo等[16]，即8個文庫共得到56.68 Gb的序列。根據可溶性固形物含量的變化，CPPU處理果實中共篩選出2 009個上調表達的基因，對照果實中有1 761個上調表達的基因，二者均為上調的基因有580個。

2.3 糖代謝相關基因的GO富集

對2.2中580個均為上調的基因進行GO富集分析，如圖2。對注釋基因的功能進行歸類，即生物過程、細胞構成和分子作用，再細化為53個二級功能。在生物過程中，細胞過程和單細胞生物過程基因數量較多；在細胞構成中，細胞部分和細胞基因數量較多；在分子作用中，約束和催化活性基因數量較多。

圖2 篩選基因的GO注釋Fig.2 GO annotation of screening gene

2.4 糖代謝相關基因的KEGG注釋

KEGG的Pathway分析如圖3。

在代謝中，基因數目最多的為氨基糖和核苷酸糖代謝途徑，其次為氧化磷酸化、糖酵解、內質網蛋白加工代謝途徑，另外還有丙酮酸、氮、脂肪酸等代謝途徑，其中的脂肪酸、醚、丙酮酸、苯丙氨酸、萜類可能與獼猴桃后熟過程中的香氣成分代謝有關[16]。

2.5 糖代謝相關基因的表達分析

根據KEGG注釋結果，有2個基因(Achn069851和Achn203191)涉及果糖和甘露糖代謝、3個基因(Achn161931、Achn199771和Achn295291)涉及戊糖和葡萄糖醛酸酯的轉化、7個基因(Achn019911、Achn069851、Achn087691、Achn161931、Achn206141、Achn270701和Achn295291)涉及淀粉和蔗糖代謝，這些基因可能與糖含量的上升有關。去除冗余基因后，剩余基因8個，其表達如圖4。

圖3 篩選基因的KEGG注釋Fig.3 KEGG annotation of screening gene

圖4 糖含量相關基因在貯藏過程中的表達變化Fig.4 Expression changes of sugar-related genes during storage

在上述8個基因中，整體表達量從高到低排列依次為基因Achn270701被注釋為葡萄糖-1-磷酸腺苷轉移酶(APS2)，基因Achn295291被注釋為編碼果膠甲酯酶(PME)，基因Achn203191 被注釋為編碼磷酸丙糖異構酶(TPI)，基因Achn161931被注釋為編碼尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶(UGD)，基因Achn087691被注釋為編碼磷酸己糖異構酶(GPI)，基因Achn069851被注釋為編碼己糖激酶(HXK)，基因Achn206141被注釋為編碼尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸酯-4-表異構酶(GAE)，基因Achn019911 被注釋為葡萄糖醛酸轉移酶(GAUT3)。可以看出，基因Achn270701在貯藏期間表達量整體高于其他基因，基因Achn019911在貯藏期間表達量整體較低。基因Achn019911、Achn069851、Achn087691和Achn203191從貯藏第2天到第8天的表達量上升緩慢，上升倍數小于1.5，而基因Achn161931、Achn206141和Achn295291在從第2～8天的表達量上升3倍以上。對照與CPPU處理基因Achn011911、Achn087691、Achn203191的相對表達量變化趨勢基本一致，且對照整體高于CPPU處理；基因Achn069851、Achn161931和Achn206141的相對表達量的均呈現對照比CPPU處理高-低-高的變化趨勢。基因Achn295291和Achn161931的相對表達量在對照和CPPU處理間差異較大，其中，在貯藏第2天對照基因Achn161931的表達量高于CPPU處理，貯藏第4天CPPU處理的表達量明顯高于對照，貯藏第6，8天對照又高于CPPU處理，對照基因Achn295291在貯藏第2，4天幾乎沒有表達，而在貯藏第6天以后表達量明顯高于CPPU處理。

3 結論與討論

獼猴桃發育過程糖積累為淀粉轉化型，即葉片光合產物輸入果實后，除用果實生長發育與呼吸消耗外，多余部分主要以淀粉形式積累于果實中直至采收，采收后的果實經后熟將淀粉轉化為可溶性糖。Cruz-Castillo 等[17]認為，施用CPPU影響海沃德獼猴桃果實發育過程中糖組分、可滴定酸的含量，成熟后對照果實糖酸含量明顯高于處理果。本研究表明，0 mg/L處理的獼猴桃果實在常溫貯藏軟化過程中可溶性固形物和糖含量較同時期20 mg/L處理的果實增高明顯，與上述研究結果吻合。

潘儼等[18]研究表明，代謝強度較高的糖酵解途徑(EMP)與蔗糖/淀粉代謝關聯，是促進香梨果心和果肉糖代謝、單糖持續積累的有利條件。磷酸己糖異構酶和磷酸丙糖異構酶，二者是EPM關鍵酶，在常溫貯藏軟化過程中，處理果基因Achn087691(編碼磷酸己糖異構酶)和基因Achn203191(編碼磷酸己糖異構酶)的表達量均低于對照果實，說明這2個基因與處理果實糖含量降低有密切關系。

己糖激酶參與催化己糖進入糖酵解的第一步不可逆反應，既能催化果糖的磷酸化又能催化葡萄糖的磷酸化。秦巧平等[19]研究表明，在溫州蜜柑果實發育過程中，可食部分果糖激酶活性逐漸降低，糖含量不斷增加，成熟期果皮蔗糖和葡萄糖含量略有下降，果糖激酶活性卻略有升高。本研究獼猴桃常溫貯藏過程中，對照和CPPU處理果實的基因Achn069851(編碼己糖激酶)表達均呈上升趨勢，CPPU處理果實從第2天到第4天表達量升高明顯高于對照，由此可見，CPPU處理后的獼猴桃果實在貯藏期糖酵解反應增強，己糖代謝量增加，是致使果實糖含量低于對照的可能原因。

尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶(UGD)催化UDP-葡萄糖氧化生成UDP-葡萄糖醛酸酯，之后轉化生成半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、芹菜糖等糖類，這些糖類是植物細胞壁中半纖維素和果膠等物質合成的前體；尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸酯-4-表異構酶(GAE)和果膠甲酯酶(PME)與果實軟化有密切的關系[20-22]，本研究中，不同處理果實的基因Achn161931(編碼尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶)、基因Achn206141(編碼尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸酯-4-表異構酶)、基因Achn295291(編碼果膠甲酯酶)在貯藏過程中均有相同的變化趨勢，CPPU處理果實第4天的表達量高于對照，第6天和第8天的表達量低于對照，由此推測，CPPU使果實提前軟化，這與龐榮等[23]在6種獼猴桃果實的研究結果相似，并且CPPU抑制了獼猴桃貯藏后期與軟化相關的酶的表達。

綜上所述，20 mg/L CPPU處理明顯影響了徐香獼猴桃果實中可溶性糖含量與相關基因的表達，致使果實常溫貯藏過程中可溶性固形物和可溶性糖含量降低，并且提前軟化。