利用秈粳交RIL群體對水稻發(fā)芽期和苗期耐冷性的QTL分析

王 棋，范淑秀，郭江華，陳兆赫，梁銀培，劉振宇，殷業(yè)超，王嘉宇

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所，遼寧 沈陽 110866)

水稻(OryzasativaL.)是重要的糧食作物之一，起源于熱帶或亞熱帶，水稻生長對低溫反應(yīng)比較敏感，培育耐冷的水稻品種是育種的主要目標(biāo)之一[1]。近年來，隨著栽培技術(shù)的發(fā)展，直播水稻具有節(jié)約成本、節(jié)約秧田等多方經(jīng)濟效益而受到人們的日益關(guān)注。目前，直播稻的種植區(qū)域主要集中在長江中下游和寧夏等稻區(qū)，種植面積占我國水稻栽培總面積的15%以上[2]。對于直播稻而言，種子萌發(fā)時的出芽率和成苗率是決定其能否穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵之一。在水稻早期生長階段，低溫冷害是降低種子發(fā)芽率和成苗率的主要因素之一[3]。因此，挖掘耐冷QTL，聚合耐冷性狀成為一亟待攻克的課題。

多數(shù)研究認(rèn)同，水稻的耐冷性是由多個基因控制的復(fù)雜農(nóng)藝性狀，根據(jù)已發(fā)表文獻和國家水稻數(shù)據(jù)中心(http://www.ricedata.cn/、http://qtaro.abr.affrc.go.jp/qtab/table)的不完全統(tǒng)計，定位或克隆耐冷相關(guān)的基因/主效QTL 98個，其中分布在第1、2、3、4、6染色體上較多，共60個；而第10、12染色體上很少，僅為6個[4-5]。不同學(xué)者利用不同的耐冷鑒定方法，定位群體檢測到的QTL位點和數(shù)量不同，相同QTL在不同遺傳背景下所具有的遺傳效應(yīng)也存在較大差異。Baruah等[6]對比了57份水稻品種的耐冷性，發(fā)現(xiàn)在生長早期，粳稻的耐冷性明顯優(yōu)于秈稻和普通野生稻，并利用RIL群體定位到5個耐冷QTL。陳瑋等[7]利用秈粳交構(gòu)建RIL群體，以卷紙法進行耐冷鑒定，將芽期耐冷QTL定位于第1、3、7、11染色體上。楊洛淼等[8]利用粳粳交的RIL群體，在15 ℃和5 ℃低溫條件下分別對水稻發(fā)芽期和芽期進行耐冷性鑒定，檢測到1個芽期耐冷QTL和17個控制低溫發(fā)芽力的QTL，單個QTL貢獻率為5.54%～35.67%；周勇等[9]以秈稻親本9311為受體，粳稻親本日本晴為供體構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的單片段代換系BC5F4群體進行QTL分析，定位到23個與芽期和苗期耐冷相關(guān)的QTL，其中qCTP12.1、qCTP12.2能在2個時期同時檢測到；Zhao等[10]以東鄉(xiāng)野生稻為供體構(gòu)建了159個片段代換系，定位到7個耐冷QTL，并鑒定1株極耐寒株系SIL157，通過基因表達(dá)量的分析確定了6個在冷脅迫下上調(diào)的候選基因。王會民等[11]結(jié)合前人研究結(jié)果，鑒定出一個主效QTL-qCT10，并通過構(gòu)建近等基因系將其定位到224.5 kb內(nèi)。然而，檢測到水稻生長早期耐冷的QTL仍然較少，且利用同一群體對發(fā)芽期和苗期進行耐冷QTL分析的報道也相對較少。本研究以遼寧省超級粳稻品種沈農(nóng)265和四川秈稻品種瀘恢99構(gòu)建RIL群體，對水稻發(fā)芽期和苗期進行耐冷QTL分析，以期進一步發(fā)掘耐冷性新基因，豐富水稻耐冷相關(guān)機制的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以南方秈型雜交稻恢復(fù)系品種瀘恢99為母本，北方粳型超級稻品種沈農(nóng)265為父本配置雜交組合，采用單粒傳法獲得144個F8穩(wěn)定遺傳的RIL群體作為試驗材料。

1.2 發(fā)芽期耐冷性鑒定

發(fā)芽期耐冷性鑒定參考李太貴[12]的方法稍加改動。將種子在50 ℃恒溫箱內(nèi)高溫處理48 h，使其充分干燥和打破休眠。挑選飽滿種子100粒，均勻放置于墊濾紙的培養(yǎng)皿中， 3次重復(fù)。用消毒液浸種10 min后，用自來水洗滌3～4次。加入少量水浸種24 h后，再用自來水洗滌2～3次，放入14 ℃低溫恒溫箱中處理。低溫下處理種子14 d，調(diào)查種子發(fā)芽率。發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)以芽長達(dá)到種子長度的一半(約5 mm)，根長達(dá)到種子長度時記為發(fā)芽(約10 mm)。

1.3 苗期耐冷性鑒定

苗期耐冷性參照韓龍植等[13]方法。種子按常規(guī)方法經(jīng)消毒、浸種和催芽，將催芽的種子播種于裝有床土的育苗盤中。每個材料播15～20粒，以2 cm距離點播，3次重復(fù)。在20～30 ℃的溫室中育苗。3-4葉期，把材料放入5 ℃人工氣候箱中處理7 d。低溫處理后，將材料移至溫度20～30 ℃，并有陽光的溫室進行恢復(fù)性生長。7 d后調(diào)查幼苗的耐冷性。以葉赤枯度作為幼苗期耐冷性的評價標(biāo)準(zhǔn)，共分1～9級(表1)。

表1 苗期耐冷性評價標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Evaluation standard of seedling stage in rice

1.4 QTL分析

利用Excel 2010軟件對發(fā)芽期和苗期耐冷數(shù)據(jù)進行處理，運用SPSS(Version 17.0 for Windows)軟件進行統(tǒng)計和相關(guān)性檢驗分析。

親本和RIL群體的基因組DNA 均采用CTAB法提取。利用均勻分布在12條染色體上的456對(包含SSR、Indel、SSILP)引物對親本進行多態(tài)性篩選，10 μL PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2.0 μL，10 μmol/L 引物1.0 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.8 μL，5 U/μLTaq酶0.1 μL，ddH2O 4.1 μL。PCR擴增反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性40 s，50～58 ℃退火40 s，72 ℃復(fù)性40 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，保存于12 ℃?zhèn)溆谩７磻?yīng)產(chǎn)物在4%～5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，經(jīng)GoldView染色后在凝膠成像儀上成像并記錄數(shù)據(jù)。最終篩出179對多態(tài)性良好的標(biāo)記用于構(gòu)建遺傳圖譜[14]，采用QTL ICI Mapping v3.0的完備區(qū)間作圖(ICIM)方法[15]進行QTL分析，LOD的閾值設(shè)為2.5，當(dāng)實際求得的LOD值大于LOD閾值時，就判定該區(qū)段存在1個QTL，同時估算每個QTL的加性效應(yīng)值和貢獻率。QTL的命名遵循McCouch等原則[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽期和苗期耐冷的表型分布及相關(guān)性分析

沈農(nóng)265和瀘恢99在發(fā)芽期和苗期耐冷性上存在顯著差異(表2)。在低溫條件下， RIL群體種子相對發(fā)芽率存在較大幅度變異，呈現(xiàn)雙向超親分離，表現(xiàn)為近似連續(xù)正態(tài)分布。同樣，冷處理后RIL群體苗期耐冷性存在較大幅度變異，近似于正態(tài)分布，表明這2個耐冷性狀均表現(xiàn)為數(shù)量遺傳，符合QTL的作圖要求(圖1、表2)。

表2 發(fā)芽期和苗期耐冷在RILs群體中的分布情況Tab.2 Distribution of germination and seedling stage traits in RILs populations

注：同一行數(shù)據(jù)后不同字母表示0.05水平的顯著性。

Note:The same row of date is followed by different letters to indicate the significance of 0.05 level.

圖1 低溫條件下發(fā)芽率(左)和苗期耐冷性等級(右)分布Fig.1 Distribution of germination rate (left) and cold tolerance (right) at low temperature

2.2 發(fā)芽期和苗期耐冷性狀QTL定位

通過完備復(fù)合區(qū)間作圖法分析(圖2、表3)，共檢測到2個控制發(fā)芽期耐冷性的QTL，分別位于第3和第5染色體上，命名為qLTG-3、qLTG-5，相應(yīng)染色體上的區(qū)域為分子標(biāo)記STS4～RM22和R5M13～RS8，遺傳距離約4.4，8.0 cM，LOD值為3.60，2.73，加性效應(yīng)為0.09，-0.10，可解釋表型變異的11.02%，14.07%，增效等位基因分別來源于親本沈農(nóng)265和瀘恢99；檢測到1個控制苗期耐冷性的QTL，位于第9染色體上，命名為qSCT-9，相應(yīng)染色體的區(qū)域為分子標(biāo)記RS19～RS20，遺傳距離約4.9 cM，LOD值為2.52，加性效應(yīng)為-0.09，可解釋表型變異的12.18%，增效等位基因來源于親本瀘恢99。

表3 檢測到的耐冷性QTL位點Tab.3 QTL for cold resistant detected at germination stage and seedling stage

圖2 發(fā)芽期和苗期檢測到的耐冷性QTLs在染色體上的分布Fig.2 Chromosome localization of QTLs for cold tolerance detected at germination stage and seedling stage

3 結(jié)論與討論

水稻是世界上近一半人口的口糧作物，提高水稻的產(chǎn)量、抗性和品質(zhì)是水稻育種家的首要任務(wù)。其中，提高對各種逆境的耐受性是保障產(chǎn)量和品質(zhì)的先決條件。一直以來，有關(guān)低溫引起水稻產(chǎn)量降低的報道屢見不鮮，據(jù)統(tǒng)計，我國每年因低溫冷害使稻谷減產(chǎn)30億～50億kg。水稻在早期生長易受低溫侵襲而造成冷害。在發(fā)芽期，低溫會導(dǎo)致種子發(fā)芽時間延長，發(fā)芽率下降；苗期則會延遲生長甚至死亡[17-20]。因此，挖掘耐冷基因，聚合耐冷性狀對于常規(guī)栽培稻和直播水稻都具有重要意義。在水稻發(fā)芽期和苗期耐冷性的研究方面，研究人員(韓龍植等[13]、紀(jì)素蘭等[21]、周勇等[9]、陳大洲等[22]、夏瑞祥等[23])利用不同的遺傳群體在12條染色體上均有檢測到耐冷相關(guān)的QTL，其中qLTG4、qLTG3-1、qLTG3-2、qLTG-6、qLTG-11、qSCT-1、qSCT-2、qRC10-1-1、qRC10-1-2等在不同親緣的遺傳背景下在相同區(qū)間內(nèi)重復(fù)檢測到，說明這些QTL廣泛、真實的存在于不同的水稻品種中。

本研究檢測到的qLTG-3與水稻低溫發(fā)芽勢主效控制基因qLTG3-1位置一致[24]，該基因編碼1個功能未知的蛋白，在種子發(fā)芽過程中，qLTG3-1 特異的在種皮的糊粉層和覆蓋胚芽鞘的上胚層表達(dá)，可能通過調(diào)節(jié)這些組織的細(xì)胞液泡化，從而引起這些組織的松弛而提高種子在低溫下的發(fā)芽勢。位于第9染色體上的qSCT-9與苗期低溫失綠cisc(t)[25]和詹慶才等[26]檢測到的控制苗期耐冷性的QTL區(qū)間相同。在該區(qū)間內(nèi)存在1個編碼脅迫蛋白的基因(OSISAP1、LOC_Os09g31200)，研究表明，過量表達(dá)OSISAP1基因的轉(zhuǎn)基因煙草對冷、干旱和鹽脅迫具有耐受性[27]。在相鄰區(qū)間存在OsDREB1A、OsDREB1B基因，這2個基因在轉(zhuǎn)化擬南芥植株中表現(xiàn)出耐低溫等特征[28]。檢測到的qLTG-5位于第5染色體R5M13～RS8標(biāo)記，貢獻率12.18%，該區(qū)間未見相關(guān)水稻發(fā)芽期耐冷的QTL報道，可能為一新的控制水稻發(fā)芽期耐冷性的QTL。

此外，本研究中的qLTG-5和qLTG-9增效等位基因均來自秈稻品種瀘恢99，這與多數(shù)學(xué)者的研究不謀而合，即秈稻中可能隱藏著一些耐冷QTL位點，并且這些耐冷位點在不同親緣背景下構(gòu)建的遺傳群體中是可以穩(wěn)定表達(dá)的，因此，在秈稻品種中發(fā)掘、分離、聚合耐冷基因亦是可行的。以上研究期望為水稻耐冷分子遺傳機制的研究奠定基礎(chǔ)。