谷子SSR標記與光周期敏感性的關聯分析

賈小平,張 博，李劍峰，袁璽壘，陸 平，戴凌峰

(1.河南科技大學 農學院，河南 洛陽 471003;2.中國農業科學院 作物科學研究所,北京 100081)

光周期是影響植物生長發育及生態適應性的重要因素[1]。在Garner等[2]發現光周期反應現象之后，有關植物光周期敏感性研究的報道不斷增加。如唐志明等[3]認為，株高不同的水稻與光溫敏感性的大小有關，研究結果發現株高越高的水稻光溫敏感性也越強。王翠玲等[4]對熱帶、亞熱帶玉米光周期敏感性進行了研究，為克服我國玉米種質資源的局限性提供了方案。楊玉杰等[5]研究了植物種子的萌芽、幼苗的生長、開花以及根系生長與光周期間的關系，表明光周期對植物生長發育存在全方位的影響。此外，對小麥[6]、芝麻[7]等作物的生長、結實與光周期之間的聯系也進行了研究。

谷子是常見的食用雜糧，最早發現于黃河流域，在我國已有悠久的種植歷史。由于谷子屬于短日照喜溫作物，對光溫比較敏感，導致其生態適應性狹窄，生產上缺少跨區的主栽品種。目前對谷子光周期敏感性的研究較少，趙治海等[8]利用遺傳學的方法在292雜交后代中選育出了光(溫)敏不育系821，發現該不育材料在長日照下是低敏不育的，在育性轉換方面適合種植在北方春谷區常年氣候條件，不育性穩定，利用面廣。河南科技大學農學院與河北省農林科學院谷子研究所合作開展研究，前期已經對谷子主要農藝性狀的光溫敏感性進行了系統評價，發現抽穗期、穗長、穗碼數對光周期較敏感，其次是葉片數，這4個性狀適合作為谷子光周期敏感性評價的指標[9-10]。國內外學者利用谷子開花期作為指標性狀，利用經典的雜交群體作圖法將光周期敏感性位定位于3，4，9號染色體上[11-12]。為檢測到新的光周期敏感性位點，進一步揭示谷子光周期敏感性的遺傳基礎，本研究在海南、洛陽2個不同光周期條件下調查了45份來自不同生態區谷子品種的抽穗期，用兩地抽穗日數相對差值計算光周期敏感性，用40個SSR標記對45份谷子材料進行多態性掃描，并進行標記與谷子光周期敏感性的關聯分析，發掘與光周期敏感性關聯的SSR標記，并在關聯標記區域進行候選基因分析。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

45份谷子材料見表1，分別于2015年5月中旬、10月底種植在河南省洛陽市河南科技大學開元校區試驗田、海南省樂東縣河北省農林科學院谷子研究所試驗田，2015年6月-2016年1月在兩地進行抽穗期調查。

表1 試驗所用谷子品種材料Tab.1 The foxtail millet cultivars used in this study

1.2 試驗設計與農藝指標調查

45份谷子材料按照行距40 cm、株距3～5 cm、保護行35 cm進行種植，管理方法按當地常規管理。記錄出苗期、抽穗期的方法見文獻[13-14]。穗日數=抽穗期-出苗期，每個品種的光周期敏感性=(洛陽長日照抽穗日數-海南短日照抽穗日數)/短日照抽穗日數×100%。

1.3 谷子DNA的提取及PCR檢測

采用2×CTAB法提取谷子DNA。40個SSR標記信息來自文獻[15](表2)。PCR擴增體系(10 μL)：基因組DNA為1 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 為5 μL，ddH2O(滅菌) 為3 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性35 s，55～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，34個循環;72 ℃延伸5 min。

表2 本研究所用的40個SSR標記信息Tab.2 The information of 40 SSR markers used in this study

表2(續)

1.4 數據分析

1.4.1 谷子材料群體結構分析 用STRUCTURE 1.8軟件對45份谷子材料進行群體遺傳結構分析，確定最佳群體數K值，用Evanno等[16]的方法計算出ΔK，并選擇適宜的K值。

1.4.2 SSR標記間連鎖不平衡分析 用TASSEL 2.1軟件估計SSR標記間的連鎖不平衡情況，計算SSR成對位點間R2值和成對位點間LD的概率P值。

1.4.3 SSR標記與光周期敏感性的關聯分析 用TASSEL 2.1軟件中的GLM程序進行光周期敏感值與SSR標記的關聯分析，并估計出統計檢驗的P值。

2 結果與分析

2.1 45份谷子材料光周期敏感性評價

45份谷子材料的光周期敏感值為0～1.917，其中鄭8041(14)的光周期敏感值最大，為1.917，最敏感，其次為呼和浩特大毛谷，光周期敏感度值為1.667。光周期敏感值最小的為SET3/80，敏感度值為0。龍谷26、小早谷光周期敏感值也較小，均為0.417(表3)。

表3 谷子品種光周期敏感值Tab.3 Photoperiod sensitivity values of foxtail millet cultivars

2.2 SSR標記多態性檢測

用40個SSR引物標記在45份谷子材料進行擴增，進行PAGE電泳,檢測引物多態性。40個引物中檢測到的等位基因個數為2～6，共檢測出150個等位基因，平均每個引物檢測等位基因數為3.75個。其中，p91、b158和p61引物檢測出等位基因數最少，為2個；b200和b124引物檢測等位基因數最多，為6個(表4和圖1)。

M. 50 bp lander。

表4 40個SSR標記的等位基因數統計Tab.4 Allele number statistics of 40 SSR markers

2.3 谷子群體遺傳結構分析

群體結構分析確定谷子品種群體適宜的亞群數為3，結果見圖2。從圖中可以看出，有5個品種在第1亞群，分別來源于河北省、河南省。16個品種在第2亞群，分別來源于法國、河南省、河北省、山東省、黑龍江省、內蒙古自治區。21個品種在第3亞群，分別來源于朝鮮、德國、日本、美國、內蒙古自治區、黑龍江省、北京市、河北省、陜西省、河南省。剩余3個品種來自河南省、內蒙古自治區、德國，這3個品種分群模糊，組成混合組。

圖2 每個谷子品種歸屬3個亞群的概率Fig.2 Probability diagram of each cultivar belonging to three subgroups

2.4 SSR標記間的連鎖不平衡分析

SSR標記間的連鎖不平衡分析結果見圖3。相關系數R2是位于對角線上方的三角形中，其相對應的P值位于對角線下方的三角形中。自然群體中用連鎖不平衡系數R2越靠近1代表連鎖關系越強，從圖3可以看出，40個SSR標記間不存在明顯的連鎖不平衡現象。

黑色對角線上方的每一格表示SSR成對位點間R2值；對角線下方每一格表示成對位點LD的概率P值。Each cell above the black diagonal represents the R2 value between the SSR paired sites; Cell below the diagonal represents probability P value of LD between the paired sites.

2.5 SSR標記與谷子光周期敏感性的關聯分析

關聯分析結果表明，在P<0.05的顯著水平下共檢測到2個與光周期敏感性相關聯的SSR標記，即b200和b127，分別位于谷子的7號染色體和5號染色體(表5)。用這2個標記的引物序列搜索谷子基因組數據庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，發現這2個標記分別位于2個基因內部，其中b200位于登錄號為Seita.7G284800的基因內部，該基因編碼Myb類型的轉錄因子，根據基因組數據庫提供的基因共表達信息，發現Myb轉錄因子與組蛋白及其修飾相關的基因存在共表達，如組蛋白H3基因(Seita.6G070000)、組蛋白-賴氨酸-氮-甲基轉移酶基因EZH2(Seita.4G060900)、組蛋白-賴氨酸-氮-甲基轉移酶基因SU(VAR)(Seita.3G095100)。此外Myb轉錄因子還與生長素應答蛋白14(Seita.9G162900)存在共表達，因此，推斷所關聯的基因是通過表觀遺傳學修飾的方式以及生長素信號傳導的方式調控谷子光周期途徑開花。而b127位于登錄號為Seita.5G224300的基因內部，該基因編碼一個功能未注釋的蛋白DUF1644，根據數據庫提供的基因表達信息，發現該基因在藍光和遠紅光誘導條件下高度表達，與許多光周期響應蛋白存在相似性，推測該基因受光周期調控，與谷子光周期敏感性存在一定關系。

表5 與光周期敏感性關聯的SSR位點及候選基因Tab.5 The SSR loci and candidate genes associated with photoperiod sensitivity

3 結論與討論

目前有關谷子光周期敏感性研究的報道較少，國內外學者利用雜交分離群體進行了谷子光周期敏感位點的QTL定位研究，發現在谷子4號染色體存在短日照條件表達的QTL位點，而在3，9號染色體檢測到長日照條件下表達的QTL位點[11-12]，進一步的研究發現，長日照(16 h)控制開花的機制與短日照(8～12 h)存在較大的差異[17]。這些研究都是基于雙親雜交分離群體進行的，能夠檢測到的變異位點有限，而基于自然群體的關聯分析法能夠克服雜交親本變異位點有限的缺陷，檢測到更多的基因位點。利用SSR標記和重測序開發的高密度SNP標記已經成功用于谷子主要農藝性狀的全基因組關聯分析研究[18-19]，但是有關光周期敏感性的關聯分析研究還未見報道。本研究利用SSR標記首次開展了谷子光周期敏感性的關聯分析，在谷子5號染色體和7號染色體各檢測到1個與光周期敏感性關聯的SSR標記(b127與b200)，并且這2個SSR位點均位于功能基因的內部，其中b127位于一個功能未注釋的基因DUF1644內部，b200位于一個Myb轉錄因子基因內部，這2個基因在水稻、擬南芥光周期敏感性研究中還未報道過，因此，可能為新的光周期途徑調控基因。

本研究在7號染色體關聯到1個Myb轉錄因子基因，該基因與1個組蛋白基因H3、2個組蛋白修飾基因組蛋白-賴氨酸-氮-甲基轉移酶基因EZH2、SU(VAR)存在共表達。在擬南芥開花調控研究中，發現組蛋白H3特定賴氨酸殘基甲基化可以調節環境溫度誘導的開花基因可變剪切體發生變化，從而影響開花期[20]。而在水稻的研究中，發現在長日照條件下抑制組蛋白賴氨酸甲基轉移酶基因OsTrx1的表達可以延遲水稻開花[21]。因此,推測本研究所關聯的Myb轉錄因子基因可能通過參與對組蛋白H3甲基化修飾來調控谷子開花。在5號染色體關聯到的一個功能未注釋基因DUF1644，該基因在藍光和遠紅光誘導下高度表達。研究表明，擬南芥F-BOX基因FOA2受藍光、遠紅光誘導表達，突變藍光受體、紅光受體及遠紅光受體則導致該基因光誘導表達效應減弱或消失，說明FOA2基因為光信號通路基因[22]。本研究獲得的受藍光、遠紅光誘導表達的DUF1644基因可能為光信號通路相關基因，參與光周期途徑調控的谷子開花，但仍需進一步進行功能驗證。