基于響應面法優化咖啡乳酒發酵工藝

沈燕萍，王 琪，劉琨毅*，鄒 偉，夏熙洋

（1.宜賓職業技術學院 五糧液技術學院，四川 宜賓644003；2.四川理工學院生物工程學院，四川 自貢643000；3.宜賓市三中，四川 宜賓644000）

目前，市面上大部分的乳酒都是以馬奶或羊奶為原料，傳統的乳酒是在鮮奶中加入天然發酵劑，經自然發酵形成，但因傳統的生產工藝制約，使乳酒產品的質量經常出現不穩定的現象[1-4]。隨著消費者對健康食品要求的不斷提高，市場急需將這種傳統飲品工業化生產，其中發酵劑在乳酒的加工過程中起著至關重要的作用[5-8]。根據文獻報道，制備乳酒時使用兩種及兩種以上菌種可以提高產品質量，當酵母菌聯合乳酸菌，且酵母菌與乳酸菌的比例為2∶1時，乳酒的品質得到明顯提升[9-12]。開菲爾菌是傳統發酵奶制品開菲爾的發酵劑，開菲爾不僅有著與普通酸牛奶同樣的營養價值，而且具有一定的保健功能[13-16]。

復合型發酵酒是使用兩種或兩種以上的釀酒原料發酵而成的酒品，其能綜合兩種或兩種以上原料的特點與優勢，彌補利用單一原料釀酒在色、香、味上的欠缺和營養成分不足等缺陷[17-18]。因復合型發酵酒利用了多種釀造原料，并采用先進的釀造工藝，使其風味獨特，深受消費者的喜愛[8，16-18]。咖啡風味濃郁，具有獨特的花香味、果香味、草香味且功效獨特，正在逐步成為時下的流行飲品[19-21]。

因此，本試驗以開菲爾菌（Kefir）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為發酵劑，通過咖啡與牛奶混合發酵釀造乳酒，利用單因素試驗及響應面試驗對其發酵工藝進行優化，以期釀出的酒體風味突出、口感幼滑、酸度適中的咖啡乳酒，為工業化生產提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

開菲爾菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）滬釀2.069：宜賓職業技術學院菌種保藏中心；咖啡（雀巢）、純牛奶（伊利）、白砂糖：宜賓大潤發超市；冰乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：湖北鑫潤德化工有限公司；亞硫酸鈉（分析純）：南京試劑有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：無錫市亞泰聯合化工有限公司；次甲基藍（指示劑）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

FA20043型電子天平：上海越平科學儀器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機：鄭州長城工貿有限公司；MC-GNP-9080系列隔水式恒溫培養箱：青島明成環保科技有限公司；DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌器：上海申安醫療器械廠；KL-30-10000型乳化均質機：上海科勞機械設備有限公司；BCD-2HBSA型電冰箱：青島海爾股分有限公司；PHs-3c型精密pH計：上海理達儀器廠；AT6000型酒精度測試儀：意大利蓋博分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 咖啡乳酒釀造工藝流程及操作要點

牛奶、咖啡、白砂糖、亞硫酸鈉→攪拌→過濾→加熱→均質→殺菌→冷卻→接入開菲爾菌與釀酒酵母→發酵→后熟→成品

操作要點：在牛奶中添加一定比例的咖啡、白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，利用檸檬酸鹽緩沖液調節pH值為6.5，攪拌至白砂糖完全溶解，過濾后加熱至55～65 ℃，采用乳化均質機（壓力為15 MPa）均質，均質后在90～95 ℃條件下加熱殺菌5 min；待樣品冷卻后，在無菌條件下接入一定量的經活化后的酵母菌懸液和1%的開菲爾菌，25 ℃條件下發酵，待發酵完成后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。

1.3.2 理化指標測定方法[22]

總糖含量（以葡萄糖計）測定：斐林試劑法；酒精度測定：密度瓶法；總酸含量測定：電位滴定法；氨基酸態氮含量測定：甲醛滴定法。

1.3.3 感官評價

感官評價在學院食品品評室內完成，邀請13位教師及實驗員組成評定小組，明確感官評定的指標和注意事項。參照王璐等[2]及GB/T 23546—2009《奶酒》[22]從色澤、組織形態、香氣、滋味、典型性5個方面制定咖啡乳酒感官評價標準，滿分為100分，評價標準如表1所示。

表1 咖啡乳酒的評分標準Table 1 Evaluation standards of coffee koumiss

續表

1.3.4 咖啡乳酒發酵工藝條件優化單因素試驗

白砂糖添加量對咖啡乳酒感官品質的影響：在牛奶中加入1.2%的咖啡后煮沸，分別加入4%、6%、8%、10%、12%的白砂糖，加入0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.3%的釀酒酵母及1%的開菲爾菌，25 ℃條件下發酵4 d后分別記錄咖啡乳酒的感官特征，以確定最佳的白砂糖添加量。

同理，依次考察咖啡添加量（0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、釀酒酵母接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及發酵時間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）對咖啡乳酒感官評分的影響，以確定較佳的咖啡添加量、釀酒酵母接種量、發酵時間。

1.3.5 咖啡乳酒發酵工藝條件優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取白砂糖添加量（A）、咖啡添加量（B）、釀酒酵母接種量（C）、發酵時間（D）為考察因素，以感官評分（Y）為評價指標，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，進行4因素3水平的響應面分析試驗，確定咖啡乳酒最佳的發酵工藝條件，因素與水平見表2。

表2 咖啡乳酒發酵工藝條件優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of coffee koumiss

1.3.6 數據分析處理方法

以上每個試驗重復3次，結果取平均值。采用OriginPro 9.1軟件進行數據制圖和統計分析。采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 咖啡乳酒發酵工藝條件優化單因素試驗結果

圖1 白砂糖添加量對咖啡乳酒感官評分的影響Fig. 1 Effect of sugar addition on sensory evaluation of coffee koumiss

2.1.1 白砂糖添加量對咖啡乳酒感官評分的影響由圖1可知，當咖啡乳酒中白砂糖添加量從4%增加到10%時，咖啡乳酒的感官評分也隨之增加；當添加量達到10%時，咖啡乳酒的感官評分達到最高分，為（83.1±1.0）分。但隨著白砂糖添加量的繼續增加，咖啡乳酒的感官評分開始呈現下降的趨勢。糖分在咖啡乳酒發酵過程中主要轉化為乙醇，也可以轉化成酸類、酯類、醛類等物質[8]，咖啡乳酒在發酵過程中，可發酵性糖過少會出現酒體不豐滿、香味不足的現象，可發酵性糖過多則會造成酒體酸度偏大等不良現象。故選用白砂糖添加量為8%、10%及12%用于后續響應面優化試驗。

2.1.2 咖啡添加量對咖啡乳酒感官評分的影響

圖2 咖啡添加量對咖啡乳酒感官評分的影響Fig. 2 Effect of coffee addition on sensory evaluation of coffee koumiss

由圖2可知，咖啡能顯著改善乳酒的風味特征（P＜0.05），不僅能克服乳酒香味不夠豐滿的缺點，而且能賦予乳酒獨特的香醇。咖啡乳酒的感官評分隨著咖啡添加量的增加而呈現出先增高后降低的趨勢，當咖啡添加量為1.2%時，咖啡乳酒的感官評分達到最高，為（82.5±0.7）分。因咖啡含有一定量的苦味物質，故咖啡加入量過大會導致咖啡乳酒呈現出較強的苦味，因此，當咖啡添加量適當時才能賦予咖啡乳酒特殊的風味及口感。由此選擇0.8%、1.2%、1.6%的咖啡添加量進行響應面優化試驗。

2.1.3 釀酒酵母接種量對咖啡乳酒感官評分的影響

圖3 釀酒酵母接種量對咖啡乳酒感官評分的影響Fig. 3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on sensory evaluation of coffee koumiss

由圖3可知，隨著釀酒酵母接種量的不斷增加，咖啡乳酒的感官評分也隨之不斷增加。當釀酒酵母接種量為0.5%時，咖啡乳酒的感官評分達到最高，為（83.5±1.0）分。酵母菌在發酵過程中能將可發酵性糖轉化為二氧化碳和乙醇，同時還會產生一些醇、醛、酸、酯等香味物質[12]。當酵母菌接種量較低時，容易使釀酒原料不完全發酵，造成咖啡乳酒的酒度偏低、酒香不突出等現象。當酵母菌的接種量為0.4%時，咖啡乳酒的感官評分雖然較釀酒酵母接種量為0.5%時低，但兩者并無顯著性差異（P＞0.05）。所以選擇酵母菌接種量為0.3%～0.5%進行響應面優化試驗。

2.1.4 發酵時間對咖啡乳酒感官評分的影響

圖4 發酵時間對咖啡乳酒感官評分的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of coffee koumiss

由圖4可知，當咖啡乳酒的發酵時間為3 d時，咖啡乳酒的感官評分最高，為（87.1±0.7）分。當發酵時間＜3 d之前，可發酵性糖類還未完全被酵母菌所利用，酒體略顯寡淡，香味不濃郁。當發酵時間＞3 d之后，咖啡乳酒的酸度開始逐漸增大、苦味開始逐漸變淡，破壞了酒體的風味。其原因可能是開菲爾菌在長時間發酵過程中產生了大量的乳酸，咖啡中的苦味物質被微生物逐漸分解代謝。因此，選擇發酵時間為2～4 d進行響應面優化試驗。

2.2 咖啡乳酒發酵工藝條件優化響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以咖啡乳酒的感官評分（Y）為響應值，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，通過Design Expert 8.0.6軟件設計響應面法試驗，考察白砂糖添加量（A）、咖啡添加量（B）、釀酒酵母接種量（C）、發酵時間（D）4個因素對咖啡乳酒感官評分的影響，響應面試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 咖啡乳酒發酵工藝條件優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of coffee koumiss

經Design Expert 8.0.6軟件對表3中的數據進行多元回歸擬合，得到咖啡乳酒感官評分的回歸方程：

Y=87.52+0.38A+0.15B-0.30C+1.57D+0.97AB+0.08AC+2.25AD-0.35BC+0.62BD-2.18CD-3.32A2-2.44B2-2.92C2-2.79D2

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型極為顯著（P＜0.01），且失擬項檢驗不顯著（P＞0.05），表明未知因素對試驗結果的干擾較小，該試驗模型充分擬合試驗數據，可以用于確定咖啡乳酒釀造的最佳工藝。4個因素對咖啡乳酒感官評分影響的主次順序依次為D＞A＞C＞B，即發酵時間＞白砂糖添加量＞釀酒酵母接種量＞咖啡添加量，其中二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項D和交互項AD、CD對結果影響顯著（P＜0.05），其他項則對結果影響不顯著（P＞0.05）。

根據咖啡乳酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應面分析圖，結果見圖5。

由圖5可知，因素A與因素D之間以及因素C與因素D之間所形成的響應面曲面坡度在兩因素交互作用響應面圖中最為陡峭，即因素A與因素D以及因素C與因素D之間具有最強的交互作用。

通過Design Expert 8.0.6軟件分析確定咖啡乳酒的最佳發酵工藝條件為白砂糖添加量10.49%、咖啡添加量1.26%、釀酒酵母接種量0.38%及發酵時間3.49 d，在此優化條件下，咖啡乳酒感官評分的理論值為89.0分。為便于實際操作，將咖啡乳酒的最佳發酵工藝條件修訂為白砂糖添加量10.5%、咖啡添加量1.3%、釀酒酵母接種量0.4%及發酵時間3.5 d，在此最優發酵工藝條件下，驗證得到咖啡乳酒的感官評分為（88.9±1.1）分，與理論值相近，證明該結果合理可靠。

圖5 各因素交互作用對咖啡乳酒感官評分的響應面曲線及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of coffee koumiss

2.3 理化指標分析

在最佳發酵工藝條件下得到的咖啡乳酒在的總糖含量為14.3 g/L、酒精度為3.2%vol、總酸含量為6.4 g/L、氨基酸態氮含量為0.18 g/L。咖啡乳酒的理化指標均符合國標GB/T 23546—2009《奶酒》[22]的標準。

3 結論

在單因素試驗的基礎上采用響應面法對咖啡乳酒的發酵工藝條件進行了優化，確定其最優發酵工藝條件：在牛奶中添加1.3%的咖啡、10.5%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，攪拌至白砂糖完全溶解，過濾后加熱至55～65 ℃，進入乳化均質機（壓力為15 MPa）均質，均質后在90～95 ℃加熱殺菌5 min，冷卻后在無菌條件下接入0.4%經活化后的釀酒酵母菌懸液和1%的開菲爾菌，25 ℃條件發酵3.5 d后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。此優化條件下獲得的咖啡乳酒的色澤褐黃透明，咖啡香、奶香與酒香和諧，酒體豐滿圓潤的咖啡乳酒，其感官評分為88.9分。