miR-30b在膀胱癌中表達的臨床意義及對膀胱癌細胞生物學特性影響研究

李利軍，邱明星，馬志偉，龔百生

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院泌尿外科，四川 成都 610072)

膀胱癌是最常見的泌尿生殖系統癌癥，是影響患者健康及生命安全的惡性疾病，發病率及死亡率均較高。目前臨床對于此類疾病主要采用手術切除為主，化療、放療等綜合治療為輔，但療效均不理想[1，2]。尋找膀胱癌的發病基因，從遺傳學途徑了解膀胱癌的發生機制，是膀胱癌診療的基礎[3]。MicroRNA是一種內源性的具有調控功能的小分子RNA，通常在轉錄后表達，研究表明[4，5]，miRNA能夠參與癌細胞的各項生物學過程，如增殖、分化、凋亡等，miRNA具有組織特異性、時序性及保守性的特點，因此有學者認為miRNA屬于新層次上的基因表達調控，miRNA的表達可能作為腫瘤預后的重要指標。miR-30b是近年來發現在腫瘤細胞中出現異常表達的一類miRNA，研究顯示，miR-30b具有一定的抑癌基因功能[6]。但國內對于miR-30b在膀胱癌中的表達尚缺少研究。本文就miR-30b與膀胱癌的相關性，及miR-30b對膀胱癌細胞生物學特性的影響進行了研究分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2012年7月至2015年9月我院泌尿外科32例膀胱癌手術患者，男21例，女11例，年齡42～76歲[(61.3±4.9)歲]。均行膀胱切除術治療，病理檢驗證實為膀胱尿路上皮癌，取標本前均未進行過放化療或免疫治療。除取患者的腫瘤組織標本外，同時取距離腫瘤邊緣3～5 cm的正常組織作為對照標本，每份標本分別置于液氮罐及福爾馬林溶液中進行保存，固定后石蠟包埋送病理診斷。臨床分期標準參照國際抗癌聯盟2002年的TNM分期法[7]，病理分期標準參照WHO1973分級標準[8]。

1.2方法

1.2.1細胞及試劑來源 膀胱癌細胞T24、5637來自于中南大學湘雅醫學院細胞中心，腫瘤系，腫瘤細胞采用10%胎牛血清培養，培養基為DMEM培養基，置于37 ℃培養箱。培養基及胎牛血清由美國GIBCO公司生產，試劑盒由Qiagen公司生產。

1.2.2試驗方法 采用實時熒光定量檢驗。組織和細胞置入700 μlQIAzol混勻，室溫5 min；加入140 μl氯仿，震蕩搖勻，室溫放置2 min后于12000r/min下離心15 min，取上清液，加入500 μl無水乙醇，混勻，10000r/min下離心15 s，去穿流液并再次重復該步驟，洗柱，取BufferRPE500 μl置于室溫下10000r/min下離心2 min，轉移至1.5 ml收集管，加入RNase-free water 50 μl至內膜，震蕩搖勻，置于-70 ℃下保存。依次加入1ug total RNA，1 μl 10×reaction buffer，0.25 μl RiboLock Ribonuclease，0.25 μl Inhibitor，8 μl DEPC-treated water，1 μl DNase I，置于37 ℃下孵育30 min，加入1 μl EDTA并置于65 ℃下孵育10 min，添加至PCR管中，短暫離心混勻，95 ℃預變性5 min，擴增40各Cycling，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。取培養液加入96孔板，每孔100 μl，置于37 ℃條件下培養24 h，加入受試化合物，采用Dilution Buffer稀釋1/5，每孔加入50 μl 1×MTT，37 ℃下孵育4 h，吸出上清液，每孔加入150 μl DMSO，搖勻，采用酶標儀測量570 nm波長時的每孔光密度，細胞存活率=(加藥細胞OD-本底OD/對照細胞OD-本底OD)×100%。消化細胞，離心，去培養液，PBS洗1～2次，采用BSA無血清培養基重懸，調節密度為5×104ml。加入6孔板，加入1 mlFBS培養基，在Transwell上室加入細胞懸2 ml，常規培養24 h，95%酒精固定20 min，蘇木素染色10 min，200×電鏡下觀察隨機5各視野的計數。取1×107個細胞在4 ℃下離心5 min，吸去上清，PBS洗1次，取樣品細胞加入裂解液100 μl重懸，冰浴裂解15 min，4 ℃下離心10 min，將上清液轉入離心管，取少量樣品測定蛋白濃度，繪制caspase-3酶活性標準曲線圖。

1.3統計學方法采用SPSS 19.0進行數據統計。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1miR-30b的表達膀胱癌細胞中的miR-30b表達為(1.096±0.449)，與癌旁組織的(8.617±1.856)比較，顯著降低(t=-6.822，P< 0.05)。

2.2臨床分期各組中miR-30b的表達本組患者包括II期19例，III～IV期13例，其中miR-30b在II期患者的癌癥組織中表達量為(1.092±0.437)，在III～IV期患者中表達量為(1.104±0.456)，差異無統計學意義(P> 0.05)。

2.3病理分期各組中miR-30b的表達本組患者包括中低分化21例，高分化11例，miR-30b在中低分化患者中的表達量為(0.741±0.209)，在高分化患者中的表達量為(1.690±0.479)，差異有統計學意義(t=-3.145，P< 0.05)。

2.4轉染效率采用綠色熒光標記6 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞胞漿表達情況，評價轉染效率。結果顯示miR-30b的細胞轉染率達到80%以上，證明本次轉染能夠有效將miR-30b轉染于T24腫瘤細胞。見圖1、圖2。

圖1 轉染目的miR-30b mimics組轉染效率檢測

圖2 陰性對照組轉染效率檢測

2.5miR-30b對癌細胞侵襲能力的的影響將Transwell小室置入培養板，用聚碳酸酯膜隔離上下室，將T24腫瘤細胞置入上室，統計進入下室的T24數量，以此來評價癌細胞的侵襲能力。結果顯示，轉染miR-30b組T24細胞的侵襲數量為(19.43±2.06)，陰性對照組的侵染數量為(45.49±3.56)，差異有統計學意義(t=-10.974，P< 0.05)。

2.6miR-30b對癌細胞凋亡的影響采用標準曲線公式計算各組中的caspase-3酶活性，陰性對照組酶活性為(15.437±1.594)U/mg，轉染miR-30b組的酶活性為(46.019±6.004)U/mg，差異有統計學意義(t=-8.527，P< 0.05)。

3 討論

膀胱癌屬于泌尿生殖系統的常見腫瘤，目前尚無特效治療方案，研究膀胱癌的發病機制，對于預防、治療膀胱癌均有著重要的意義。既往的研究主要集中在膀胱癌細胞基因的改變上，但目前尚未有突破性進展。目前已知與膀胱癌相關的基因型較多，Derfoul等[9]的研究指出bcl-2的異常表達是導致膀胱癌輻射治療效果降低的獨立因素；Catto等[10]的研究發現膀胱癌中C-myc蛋白的表達與癌細胞的增殖、侵襲能力有顯著相關。

miRNA屬于一種小型非編碼RNA分組，這些小型的RNA實在轉錄后水平調控基因表達，屬于更高層次上的調控。CNS將miNRA的研究進展列為十大科技突破之一，肯定了miRNA在癌細胞機制研究中的意義[11]。腫瘤細胞與正常組織miRNA的表達存在顯著差異，且大多數miRNA都處于相對脆弱的基因位點上，這提示miRNA可能在腫瘤的行程中有著重要的作用。Feng等[12]對412個哺乳動物的樣本中的miRNA表達譜進行了分析，研究顯示miRNA的表達能提供多種有用信息，可以反映出腫瘤的分化狀態及發展譜系。Li等[13]對174例膀胱癌患者組織標本和52例正常膀胱標本進行了miRNA檢測，結果發現若干表達差異的miRNA，其中miR-145下調最為顯著，miR-21上調最為顯著，該研究指出miR-129、miR-133b等屬于具有預測腫瘤進展潛能的重要miRNA。本次研究中利用實時熒光定量檢驗對膀胱癌標本和癌旁組織進行了miR-30b的表達檢測，結果發現miR-30b在膀胱癌組織中的表達顯著低于正常組織，這提示miR-30b可能與膀胱癌的發生有所相關。

Nagaraja等[14]研究認為不同分級的膀胱癌的發生、發展途徑有所不同。有相關研究顯示，不同分級的膀胱癌的miRNA表達譜也存在顯著差異，例如miR-125b在肌層浸潤性膀胱癌中的表達最高，而miR-10則在淺表性膀胱癌中的表達最高。從本次研究情況來看，miR-30b在不同臨床分期患者中的表達并無差異，考慮原因主要是本次選擇標本均為浸潤性膀胱癌。但從病理分級來看，miR-30b的表達與腫瘤組織的分化程度有所相關，高分化的癌癥組織中miR-30b的表達相對較高，中低分化組織中的表達則相對較低，提示miR-30b可能具有抑癌基因的特點。

研究表明[15，16]，miRNA能夠廣泛的參與到基因表達的各種生物學調控中，包括細胞的增殖、侵襲、轉移及凋亡等。有研究表明[17]，miRNA是腫瘤細胞發生發展的重要因素，與腫瘤的轉歸也有密切相關，miRNA能夠參與到腫瘤細胞的周期調控、轉錄、血管生成、浸潤及凋亡等環節中，正常細胞與癌細胞中的多種miRNA表達均存在顯著差異，這說明miRNA可能在腫瘤中扮演中癌基因或抑癌基因的角色。Goebell等[18]的報道指出，包括miR-221、miR-223、miR-23b、miR-26b在內的多種miRNA均能夠在膀胱上皮癌中異常表達。Guertin等[19]的研究發現了miR-200家族，并指出miR-205在膀胱癌組織中的表達顯著降低。

細胞增殖是細胞生命活動的最基本特征。本次研究結果顯示，miR-30b在膀胱癌T24細胞中的增值速度與陰性對照組相比明顯降低，提示miR-30b能夠抑制T24細胞的增殖，發揮了抑癌基因的效果。

侵襲能力是導致癌性腫瘤患者死亡的重要因素，屬于一個復雜的動態性過程。近年來的研究顯示miRNA的表達能夠影響腫瘤細胞的侵襲性，Castedo等[20]的研究顯示miRNA200家族在未分化甲狀腺癌中的表達顯著低于高分化甲狀腺癌，推測此類miRNA的表達降低能夠促進未分化甲狀腺癌的潛在侵襲性。從本次侵襲轉移研究來看，miR-30b轉染組的T24細胞的侵襲能力相較于陰性對照組而言明顯減弱，這提示miR-30b具有抑制膀胱癌細胞侵襲能力的作用。

腫瘤細胞的凋亡與增殖功能相反，同樣決定著腫瘤的消長能力。越來越多的研究顯示miRNA屬于調控癌癥細胞增殖和凋亡的重要因素。Hansel等[21]的研究顯示miR-21在乳腺癌組織中的表達顯著增高，利用抗腫瘤ASO片段抑制乳腺癌細胞miR-21的表達后，乳腺癌細胞的生長明顯受到抑制，細胞的凋亡率增加，這個研究顯示miR-21的表達降低能夠促進乳腺癌組織的凋亡。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡過程中有著重要的作用，caspase通常以酶原形式存在，在正常組織和腫瘤組織中均有表達，一旦caspase被激活并執行致命性切割指令，即會引起細胞的凋亡[22]。本次研究檢測T24癌細胞的凋亡即是基于caspase的特性，利用測定吸光度來檢測caspase-3的活性。本次研究顯示，miR-30b轉染組的凋亡率顯著高于陰性對照組，提示miR-30b的表達越低，細胞的凋亡率也就越低。

綜上所述，膀胱癌組織中的miR-30b表達水平顯著低于癌旁組織，提示miR-30b的水平與膀胱癌的發生發展有所相關，miR-30b的表達與臨床分期無關，但與病理分期顯著相關，miR-30b導入膀胱癌細胞后，能夠顯著抑制癌細胞的侵襲能力，加速癌細胞的凋亡。