S-433?D氨基酸分析儀測(cè)定水溶肥料中氨基酸的含量

河南省土壤肥料站 主辦

隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，化學(xué)肥料的大量施用，我國(guó)的土壤肥力，特別是有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降趨勢(shì)十分明顯。為解決化肥過(guò)量施用帶來(lái)的各種問(wèn)題，改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，開(kāi)發(fā)、使用新興的水溶肥料是今后農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的必然趨勢(shì)。氨基酸水溶肥料作為一種與立體高效栽培技術(shù)、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)相配套的新型肥料，是未來(lái)肥料發(fā)展的重要方向之一。

采用S-433 D氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定含氨基酸水溶肥料中氨基酸的含量，可對(duì)目前人們所關(guān)注的所有氨基酸進(jìn)行定性定量檢測(cè)。目前，該方法已被《水溶肥料 游離氨基酸含量的測(cè)定》（NY/T 1975-2010）推薦使用，并列為仲裁法。但是標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有規(guī)定氨基酸分析的型號(hào)和樣品含量的檢測(cè)范圍，因此，本文采用此方法測(cè)定水溶肥料中游離氨基酸的含量，分別研究了進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積對(duì)氨基酸分離度的影響，以確定適宜的進(jìn)樣濃度和體積，然后對(duì)氨基酸自動(dòng)分析儀法進(jìn)行驗(yàn)證。

一、材料與方法

（一）試劑與儀器

1.試劑。0.06 mol/L的鹽酸溶液；500 g/L的氫氧化鈉溶液；50 g/L的磺基水楊酸溶液；10 g/L的EDTA-Na溶液；pH值為2.2的檸檬酸鈉緩沖液；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 2.5 ×109 nmol/mL。

2.儀器。S-433 D氨基酸分析儀；0.45μ m的微孔濾膜及過(guò)濾頭、注射器等。

（二）測(cè)定方法

1.樣品的制備。含氨基酸水溶肥料樣品經(jīng)多次縮分后，取出約100 g，將其研磨至全部通過(guò)0.50 mm的孔徑過(guò)篩，混合均勻，置于潔凈、干燥的容器中。

2.測(cè)定方法。稱(chēng)取試樣2～10 g，置于250 mL的容量瓶中。充分溶解后，加水至刻度，混勻，過(guò)濾后吸取上清液2 mL于10 mL的離心管中，準(zhǔn)確加入2 mL的磺基水樣酸溶液，混勻，放置1 h。準(zhǔn)確加入1 mL的EDTA-Na溶液和1 mL的鹽酸溶液，混勻，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾。吸取濾液1 mL，蒸干。準(zhǔn)確加入1～5 mL的檸檬酸鈉緩沖液溶解，使氨基酸濃度處于儀器最佳檢測(cè)范圍內(nèi)，供儀器測(cè)定用。

3. S-433 D氨基酸分析儀的色譜條件。色譜柱：SYKAMLCAK06/Na。流動(dòng)相A：檸檬酸鈉= 0.12 N，pH值為 3.45；流動(dòng)相B：檸檬酸鈉=0.2 N，pH值為10.85。流速：茚三酮溶液流速0.25 mL/min，洗脫液流速0.45 mL/min。檢測(cè)器1：570 nm，雙極的，12 123 mV，6.25樣品數(shù)每秒；檢測(cè)器2 ：440 nm，雙極的，12 123 mV，6.25樣品數(shù)每秒。反應(yīng)溫度：138 ℃。

（三）數(shù)據(jù)分析

本文運(yùn)用IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Microsoft Office Excel 2010制圖。

二、結(jié)果與分析

（一）進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積對(duì)氨基酸分離度的影響

為確定進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積對(duì)氨基酸峰分離度的影響，試驗(yàn)按照雙因素布置，進(jìn)樣濃度分別設(shè)為5nmol/mL、25 nmol/mL、100 nmol/mL 3個(gè)水平，進(jìn)樣體積分別設(shè)為5μL、25μ L、100μL 3個(gè)水平，共9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。按照測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)、積分后，考察蘇氨酸和絲氨酸峰形的分離度（Rh），計(jì)算公式為：

式中，H0為蘇氨酸和絲氨酸平均峰高，單位為mm；H為蘇氨酸和絲氨酸峰交點(diǎn)到基線的距離，單位為mm。

圖1 蘇氨酸-絲氨酸分離度隨進(jìn)樣量的趨勢(shì)

表1 進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積對(duì)氨基酸分離度的方差分析（因變量：蘇氨酸-絲氨酸分離度）

如表1所示，通過(guò)雙因素分析，進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積對(duì)氨基酸分離度的影響均達(dá)到極顯著水平（p＜0.001），并且存在著極顯著的交互作用（p＜0.001）。

由圖1可知，在進(jìn)樣量＜0.5 nmol時(shí)，分離度隨著進(jìn)樣量的增大而急劇增大；在進(jìn)樣量＞0.5 nmol時(shí)，分離度隨著進(jìn)樣量的增加而緩慢增加，并且在5.0 nmol之后分離度隨著進(jìn)樣量的增加而基本保持穩(wěn)定。

（二）方法的驗(yàn)證

1.穩(wěn)定性。取氨基酸含量約為15%的氨基酸水溶肥料，按照測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。由表2可知，24 h內(nèi)17種氨基酸的RSD值均在1.5%以下。其中蛋氨酸的RSD最高，為1.43%；甘氨酸的RSD最低，為0.27%。總峰面積的RSD為0.23%。

2.重復(fù)性。按照測(cè)定方法測(cè)定氨基酸含量的RSD值。如表3所示，各氨基酸含量結(jié)果的RSD值均＜1.5%。組氨酸的穩(wěn)定性最差，RSD為1.44%；天冬氨酸的穩(wěn)定性最好，RSD為0.76%。總峰面積的RSD為0.51%。

三、結(jié)論

本文探討了S-433D氨基酸分析儀的進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積對(duì)分離度的影響，明確了適宜的進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積，對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行了驗(yàn)證，得到以下結(jié)論：

（一）對(duì)于S-433 D氨基酸分析儀，分離度隨著進(jìn)樣體積和進(jìn)樣濃度的增加而提高，保持絕對(duì)進(jìn)樣量為5 nmol時(shí)，即可得到較高的分離度；當(dāng)進(jìn)樣體積為50μ L時(shí)，最適宜的上機(jī)濃度為100 nmol/mL。

（二）《水溶肥料 游離氨基酸含量的測(cè)定》（NY/T 1975-2010）氨基酸自動(dòng)分析儀法中的進(jìn)樣體積為50μL時(shí)，在 0.25～50 nmol下，重復(fù)性和24 h穩(wěn)定性的RSD均＜1.5%。

表2 17種氨基酸24 h內(nèi)的峰面積及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

表3 17種氨基酸峰面積的重復(fù)性