黃芩苷體外對白念珠菌凋亡的影響

馮 鑫， 汪長中， 汪天明， 徐振華， 韓 寧， 程惠娟， 官 妍， 王 艷

(安徽中醫學院中西醫結合臨床學院，安徽合肥230038)

近年來，以白念珠菌為主的機會性真菌感染發生率正逐年升高，尤其是其引起的深部感染往往成為真菌感染致死的主要原因［1］。同時，臨床上抗真菌藥物不僅種類少，對肝腎等器官毒副作用大，且易產生耐藥性，因此真菌感染成為臨床上棘手的難題。目前，從天然產物尤其是中藥中篩選抗真菌藥物并深入研究其抗菌機制成為近年來抗真菌藥物研發的一個熱點。本課題組前期研究發現，中藥有效成分黃芩苷對白念珠菌具有較強的抑制作用，但黃芩苷是否能誘導白念珠菌凋亡尚不明確［2-3］。本實驗擬進一步探討黃芩苷體外對白念珠菌凋亡的影響，為其抗真菌感染提供重要的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基、試劑和儀器 白念珠菌標準株ATCC10231與黃芩苷標準品 (批號110715-201016)購于中國藥品生物制品檢定所，沙氏培養基購于杭州微生物試劑有限公司，RPMI-1640培養基購于GIBCO公司，羅丹明123(Rh123)與Hoechst 33258購于 Sigma公司，二氫羅丹明(DHR)與蝸牛酶購于Ruibio公司。流式細胞儀XL為Beckman Coulter公司，熒光顯微鏡為Olympus公司產品。

1.2菌液的制備 將白念珠菌劃線接種于SDA培養后，挑選2個菌落接種于RPMI-1640(含10%小牛血清)培養基中稀釋，血球計數板計數，再以RPMI-1640培養液調整菌液密度為1×107/mL。

1.3 凋亡的藥物誘導及脫壁處理［4］在白念珠菌懸液 (1×107/mL)中分別加入黃芩苷1 000，100，10 μmol/L，37℃靜置作用16 h，另設不加藥的正常對照組 (每組n=6)。冷PBS洗2次，然后參照文獻［4］對各組細胞進行脫壁處理:即加入脫壁促進劑 (50 mmol/L K2HPO4，5 mmol/L EDTA，50 mmol/L DTT)，30℃、100 r/min搖床孵育30min，PBS洗滌2次，再轉移至1.5%蝸牛酶溶液中，30℃、100 r/min搖床孵育45 min，即得脫壁后原生質體狀態的白念珠菌。冷PBS洗2次后，用于下述流式細胞儀檢測ROS與MMP。

1.4 Hoechst 33258熒光染色觀察細胞形態改變在白念珠菌懸液 (1×107/mL)中分別加入黃芩苷1 000，100，10 μmol/L，作用 16 h，PBS洗兩次，另設正常對照組。加入4%多聚甲醛 (新鮮配制)，固定細胞 (4℃15 min)，加入Hoechst 33258(5 mg/L)染色液作用15 min，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 流式細胞術檢測細胞活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 在脫壁的原生質體狀態白念珠菌細胞懸液中，加入10 μmol/L的DHR 500 μL，室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌后用流式細胞儀檢測Rh123的平均熒光指數 (mean fluorescence index，MFI)。

1.6 流式細胞術檢測線粒體膜電位 (mitochondrial membrane exponential，MMP) 用含10%小牛血清的RPMI-1640培養基將1 g/L的Rhl23(溶于DMSO，儲存于-20℃)稀釋至終質量濃度10 mg/L，加入原生質體狀態白念珠菌懸液中，37℃避光孵育30 min，冷PBS洗滌5 min，流式細胞儀檢測MMP。

1.7 統計學處理 實驗重復3次，由SPSS17.0統計軟件分析，數據以均數±標準差表示。兩組數據采用t檢驗，多組數據采用單因素方差分析。P＜0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 黃芩苷對白念珠菌細胞形態的影響 熒光顯微鏡高倍鏡 (×400)下，Hoechst 33258染色顯示，正常對照組的白念珠菌細胞核呈彌漫均勻的低強度熒光 (圖 1A)。100 μmol/L，1000 μmol/L 濃度黃芩苷組的菌細胞呈現凋亡細胞的核濃染致密、固縮狀態或顆粒狀熒光 (圖1C，1D)，但10 μmol/L黃芩苷組的菌細胞未見明顯凋亡征象 (圖1B)。油鏡下 (×1 000)，可更清晰見到正常菌細胞的均勻一致的熒光密度，而凋亡菌細胞核則呈明顯濃縮、核碎裂等表現 (圖1E，1F)。

圖1 熒光顯微鏡觀察不同濃度黃芩苷對白念珠菌形態的影響Fig.1 Fluorescence microscopic observation of the morphological changes of Candida albicans cells exposed to baicalin

2.2 黃芩苷對白念珠菌線粒體膜電位 (MMP)的影響 黃芩苷作用于白念珠菌細胞后，反映MMP的平均熒光指數 (MFI)隨著藥物濃度的升高而降低。正常對照組 MMP值為202.88±12.20，10 μmol/L組MMP值為189.60±11.57，兩者無顯著性差 異。100 μmol/L，1 000 μmol/L 濃 度 組 的MMP值分別為167.46±9.61和161.38±9.10，與正常對照組相比較，有顯著性差異 (P＜0.05)，但100 μmol/L和1 000 μmol/L濃度組之間MMP值無顯著性差異，見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測黃芩苷作用后的白念珠菌線粒體膜電位Fig.2 Flow cytometryic analysis of MMP in baicalin-treated Candida albicans

2.3 黃芩苷對白念珠菌胞內活性氧 (ROS)水平的影響 黃芩苷作用于白念珠菌細胞后，反映ROS水平的平均熒光指數 (MFI)隨著藥物濃度的遞增而升高。正常對照組細胞釋放ROS水平較低，MFI為28.50 ±2.16，而 10 μmol/L 組、100 μmol/L組、1 000 μmol/L組的MFI分別為54.98±4.30，78.16±5.86和145.38±9.70，與正常對照組相比，有顯著性差異 (P＜0.05)，黃芩苷濃度越高誘導白念珠菌細胞釋放出的ROS越多，見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測黃芩苷作用后的白念珠菌胞內活性氧 (ROS)水平Fig.3 Flow cytometryic analysis of intracellular ROS accumulation in baicalin-treated Candida albicans

3 討論

黃芩苷 (baicalin)是中藥黃芩的主要有效成分。有文獻報道，黃芩苷具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗內毒素休克等藥理活性［5］，并對皮膚致病性真菌與多種細菌在內的病原微生物均具有較強的抑制作用［6］。本課題組前期研究發現黃芩苷對白念珠菌的黏附及生物被膜形成具有一定的抑制作用［2-3］;熊英等證實黃芩苷體外通過抑制白念珠菌的DNA、RNA、蛋白質的生物合成導致菌細胞死亡而起到殺菌作用［7］。但黃芩苷是否能通過誘導凋亡來抗白念珠菌尚未見報道。本研究即是在原有工作基礎上對黃芩苷抗白念珠菌作用機制的進一步深入探討。

凋亡是真核細胞常見的生理現象，白念珠菌為真核微生物，近年來人們發現白念珠菌也存在凋亡現象。Phillips與楊丞喆等用乙酸成功地誘導白念珠菌凋亡［4，8］;AL-Dhaheri等也觀察到兩性霉素 B能誘導生物被膜狀態的白念珠菌發生凋亡［9］。這些研究表明有望通過藥物誘導白念珠菌凋亡作為抗真菌的一個重要手段。

細胞凋亡過程中，細胞核會發生固縮、碎裂、溶解等一系列變化。本實驗中，1 000，100 μmol/L的黃芩苷作用后，熒光顯微鏡下能直接觀測到經Hoechst 33258染色所顯示的細胞核形態變化，即白念珠菌細胞核呈濃染致密、固縮狀態或顆粒狀熒光，但10 μmol/L的黃芩苷對菌細胞核無明顯影響。

線粒體不僅是維持細胞生命活動重要的細胞器，同時也在凋亡通路中發揮重要作用。一定水平的線粒體膜電位 (MMP)的維持是線粒體發揮功能的必要前提，MMP若下降會啟動細胞凋亡級聯反應，細胞即進入不可逆的凋亡過程［10］。在乙酸、兩性霉素B等誘導下，細胞可通過線粒體途徑而進入凋亡過程。本實驗中，流式細胞術檢測的MMP結果顯示，黃芩苷作用于白念珠菌細胞后，MMP隨藥物濃度遞增而呈下降趨勢，提示黃芩苷可能通過線粒體途徑誘導白念珠菌細胞凋亡。活性氧 (ROS)是真核細胞有氧呼吸過程中形成的一組化學性質活潑的具有含氧基團的化合物，且與MMP密切相關。ROS過多累積會損傷核酸、蛋白質和磷脂膜等重要細胞組分，并可降低MMP，從而誘導凋亡［11］。本實驗顯示，隨著黃芩苷濃度增高，白念珠菌細胞產生的ROS也逐漸增多，提示一定濃度的黃芩苷可能促進ROS的產生進而誘發凋亡。

從天然產物中尋找具有抗真菌活性的天然有效成分并深入闡明其作用機制，進一步將其開發應用已成為抗真菌新藥研究的重要方向。本研究表明，中藥有效成分黃芩苷可以通過線粒體途徑即降低MMP和促進ROS累積而誘導白念珠菌凋亡。近期國內姜遠英課題組發現黃芩的另一有效成分黃芩素(baicalein)也可通過誘導白念珠菌凋亡抑制其生長［12-13］，黃芩苷與黃芩素均可通過誘導凋亡方式抗白念珠菌，不僅有助于闡明黃芩及其有效成分抗真菌的作用機制，亦為其臨床防治白念珠菌感染提供重要依據。

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