發酵麥麩及其面包面團中阿拉伯木聚糖溶解性與酚酸釋放研究

羅 昆，楊文丹，馬子琳，張賓樂，湯曉娟，梁 麗，鄒奇波，鄭建仙，黃衛寧,*，Omedi Jacob OJOBI

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.張家港福吉佳食品股份有限公司，江蘇 張家港 215631；3.華南理工大學食品科學與工程學院，廣州 廣東 510641）

烘焙食品已成為世界主流食品[1]，富含高膳食纖維的麥麩面包受到消費者的廣泛歡迎。麥麩成本低[2]且富含阿拉伯木聚糖（araboxylan，AX）、酚酸及礦物質等成分，相比普通面粉更有營養價值[3]。AX能降低膽固醇、促進腸胃蠕動[4]，麥麩中AX質量分數超過25%，但水不溶性AX（water unextractable araboxylan，WUAX）和水溶性AX（water extractable araboxylan，WEAX）比例通常高于95∶5，阻礙腸胃消化吸收[5]，降低其生物利用率[6]。酚酸（如阿魏酸）具有明顯的生理活性，可用于抗氧化和抗輻射[7]，但麥麩中阿魏酸通常以結合型或束縛型存在，游離阿魏酸比例不足0.1%，能有效被人體吸收利用比例較低[8]。麥麩預發酵是一種能有效降解WUAX且釋放游離酚酸的手段，但目前關于酵母菌發酵麥麩作為面包功能配料的研究較少，且使用的酵母菌種類非常單一，多為釀酒酵母[5-10]。本研究選用馬克斯克魯維酵母是一種新型的食品安全級酵母，它在底物誘導條件下能夠分泌木聚糖酶、葡聚糖酶等水解酶[11]，因此它在麥麩發酵體系存在巨大的應用潛能。

本研究分析麥麩發酵及其面包制作過程中AX溶解性及酚酸釋放情況，以麥麩面包及木聚糖酶處理麥麩面包為對照，對比面包中AX組成特性及酚類化合物體外消化吸收率，評估發酵麥麩面包抗氧化能力，為開發營養、健康的高膳食纖維面包提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級麥麩（水分14.44%、膳食纖維45.31%、蛋白質16.91%、灰分4.10%） 河北省辛集市福之園面業有限公司；高級面包粉（水分12.14%、膳食纖維2.98%、蛋白質13.10%、灰分0.75%） 中糧鵬泰面業有限公司；馬克斯克魯維酵母菌粉（ATCC36534） 上海一研生物科技有限公司；木聚糖酶（36 500 U/g） 荷蘭皇家帝斯曼集團；胰蛋白酶（2 500 U/mg）、胃蛋白酶（1 200 U/g）、間苯三酚（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1525型高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）美國Waters公司；ICS5000型離子色譜儀（四元梯度泵）美國戴安公司；TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵麥麩制備

將馬克斯克魯維酵母活化至對數穩定期，用無菌生理鹽水將菌泥配制成濃度為4×107CFU/mL的菌懸液。取100 g麥麩，接種6 mL菌懸液，再加84 mL無菌水，調制均勻后覆上保鮮膜，于（30±0.05）℃連續培養24 h。每6 h取樣進行化學分析，剩余部分用于面包面團制作。

1.3.2 麥麩面包面團制備

麥麩面包面團：80%面包粉和20%生麥麩；木聚糖酶麥麩面包面團：80%面包粉、20%生麥麩和60 U/g木聚糖酶；發酵麥麩面包面團：80%面包粉和20%發酵麥麩；復合麥麩面包面團：80%面包粉、20%發酵麥麩和60 U/g木聚糖酶。加水量以60%粉計，發酵麥麩以濕基形式直接添加，其水分含量需要扣除；此外將木聚糖酶配制成酶液，其水分含量也需要扣除。

分別取攪拌松弛（20 min）、醒發后（2 h）的面團樣品及烘焙冷卻后的面包（中心兩片）樣品，冷凍干燥后磨粉過80 目篩，用正己烷脫脂后備用。

1.3.3 阿魏酸釋放量測定

將發酵麥麩與3 倍體積去離子水在40 ℃條件下振蕩混合1 h，于12 000×g離心15 min收集上清液。取1 mL上清液與1 mL甲醇混合均勻，再次離心保留上清液，過0.45 μm有機膜后用于色譜分析[12]。

高效液相色譜條件[13]：采用Diamonsil型C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A、B分別為甲醇和磷酸溶液（pH 2.0），洗脫方法：0～18 min由25% A變化至90% A，18～19 min由90% A變化至25% A，19～24 min保持25% A；流速1.0 mL/min；波長320 nm，進樣量20 μL。配制40～140 μg/mL阿魏酸溶液，繪制標準曲線。

1.3.4 游離酚含量測定

準確稱取適量的發酵麥麩及面包面團樣品，與25 mL預熱的70%甲醇溶液混合，70 ℃保溫10 min后離心收集上清液，重復操作，合并上清液定容至50 mL。采用福林-酚試劑法[14]測定提取液中游離酚含量。配制20～120 μg/mL沒食子酸溶液，繪制標準曲線。

1.3.5 WEAX含量測定

分別將1 g發酵麥麩及面包面團樣品與20 倍體積去離子水混合，于20 ℃振蕩20 min提取WEAX，將混合物于5 000 r/min離心10 min，得到WEAX提取液。采用間苯三酚法測定提取液中WEAX含量[15]，并按公式（1）計算。配制0.1～0.6 mg/mL D-木糖溶液，繪制標準曲線。

式中：c為標準曲線上查得木糖質量/mg；0.88為轉換因子；n為稀釋倍數；m為樣品質量/g。

1.3.6 單糖組成分析

將2 g原料粉（麥麩、發酵麥麩、小麥粉）及面包樣品與10 倍體積去離子水混合，4 ℃搖床振蕩（150 r/min）提取2 h，經過10 000×g冷凍離心后，棄沉淀。吸取5 mL提取液定容至50 mL，直接用于游離單糖測定。另外吸取2.5 mL提取液到水解管，與2.5 mL三氟乙酸溶液（4 mol/L）混合，在高溫烘箱中酸解（110 ℃，2 h），冷卻后定容至50 mL，用于可溶性糖分析。稱取10 mg原料及面包樣品加入5 mL三氟乙酸溶液（2 mol/L），于110 ℃反應2 h，冷卻定容于50 mL容量瓶，用于樣品中總糖分析。將樣品適當稀釋后過0.45 μm微孔濾膜用于單糖分析[16]。

采用離子色譜法測定樣品水解前后的單糖組成及含量，測定條件參照孫元琳等[17]的方法，按公式（2）計算AX含量，按公式（3）計算分支度：

式中：A為阿拉伯糖質量/mg；X為木糖質量/mg；0.88為轉換因子；n為稀釋倍數；m為樣品質量/g。

1.3.7 模擬胃、腸消化吸收實驗

稱取5.0 g面包凍干粉于250 mL燒杯中，加入100 mL蒸餾水溶解。用稀鹽酸調節至pH 2.0，加入1 mL胃蛋白酶溶液（將4 g胃蛋白酶分散溶解到800 mL蒸餾水，再加入16.4 mL稀鹽酸，定容至1 L），搖床振蕩反應2 h（120 r/min，37 ℃）模擬胃消化過程。反應結束，立即取15 mL胃消化液放入冰水混合物中，離心后保留上清液置于－20 ℃冰箱中貯存備用。

將25 mL NaHCO3溶液（0.5 mol/L）裝進30 cm透析袋（8 000～14 000 Da），兩端密封后放入胃消化液中。將含有消化液和透析袋的燒杯在搖床中振蕩40 min（150 r/min，37 ℃），向燒杯中加入10 mL胰酶-膽汁混合物（質量濃度分別為4 g/L和25 g/L），繼續振蕩2 h模擬腸道消化過程。結束后，向透析袋表面噴灑蒸餾水，清理殘留物。分別從燒杯（滲出液，未被人體吸收的組分）和透析袋（透析液，被人體吸收的組分）中取出15 mL反應液置于冰水混合物中冷卻，離心后保留上清液貯存在－20 ℃冰箱中備用[5]。

分別按照1.3.3節和1.3.4節方法分別測定胃消化液、腸消化液和吸收液中阿魏酸和游離酚含量。

1.3.8 麥麩面包抗氧化活性測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定：取1.3.4節提取液100 μL與3.9 mL DPPH溶液混合，避光反應30 min，在波長517 nm處測定吸光度；2,2’-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）自由基清除能力測定：取1.3.4節中提取液50 μL與5.0 mL ABTS溶液混合，避光反應10 min，在波長734 nm處測定吸光度。以20～160 μmol/L的Trolox為標樣繪制標準曲線[9]。

1.4 數據處理

除特別說明，1.3節中所有組成分析至少重復3 次，結果以 ±s表示。采用Microsoft Office Excel 2016軟件進行數據統計分析，應用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 發酵麥麩中阿魏酸、WEAX和游離酚含量測定結果

圖1 麥麩發酵過程中WEAX及酚酸含量變化Fig. 1 Changes in WEAX and phenolic acid content during wheat bran fermentation

由圖1可知，麥麩中WEAX含量約為8.01 mg/g，這與崔晨曉等[14]研究結果相近。發酵過程中，麥麩中WEAX含量從8.01 mg/g（0 h）上升至25.89 mg/g（24 h），增加2.3 倍，這與發酵麥麩中的木聚糖酶活力直接相關。Dhillon[18]和Boskov-Hansen[13]等發現麥麩本身含有一定量的木聚糖酶，可能是谷物內源酶，也可能是谷物表面附著的微生物酶。此外，AX通常與纖維素等非共價交聯形成難溶性復合體，因此纖維素酶、阿魏酸酯酶等其他酶系的存在也會促進AX溶解[19]。

由圖1可知，經過發酵后，麥麩中游離酚含量大幅度提升，發酵24 h時游離酚含量高達2.78 mg/g，這是由于發酵處理打斷了多酚與纖維素間的酯鍵、糖苷鍵或醚鍵等，多酚從束縛型或結合型轉化成游離狀態，從而被甲醇提取[20]。此外，發酵過程中谷物細胞壁破裂，細胞膜通透性增強，酚類物質更容易游離出來[21]。類似地，隨著發酵時間延長，麥麩中阿魏酸含量顯著增加（P＜0.05），這與發酵麥麩中阿魏酸酯酶和木聚糖酶活力都相關[22]。在麥麩中，阿魏酸以酯鍵形式連接在木聚糖的阿拉伯糖側鏈[8]，向麥麩中單獨添加阿魏酸酯酶時阿魏酸釋放率不足20%，結合木聚糖酶添加時釋放率提升近4 倍[23]，這是由于木聚糖酶首先將大分子半纖維素降解成阿魏酸寡聚多糖后，阿魏酸酯酶才能有效釋放阿魏酸。

2.2 麥麩及小麥粉中AX組成

表1 麥麩、發酵麥麩及小麥粉中游離單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of wheat bran, fermented wheat bran and wheat fl ourmg/g

如表1所示，麥麩中未檢測到游離阿拉伯糖，發酵后發酵麥麩中阿拉伯糖含量增加至0.39 mg/g。麥麩中游離木糖、葡萄糖和半乳糖含量分別為0.11、18.17 mg/g和0.38 mg/g，發酵后游離木糖含量未發生顯著（P＞0.05）變化。麥麩中游離果糖含量為14.22 mg/g，發酵后，發酵麥麩中游離果糖含量增加至24.94 mg/g，說明麥麩發酵過程中果聚糖發生明顯降解。小麥谷物中果聚糖含量范圍為0.9%～2.7%，Struyf等[24]發現馬克斯克魯維酵母能分泌大量轉化酶，其對面團中果聚糖和木聚糖分子具有較強的降解作用，且降解產物為釀酒酵母提供能量。小麥粉中游離木糖及游離半乳糖含量與麥麩相當，而游離葡萄糖和游離果糖含量顯著低于麥麩和發酵麥麩（P＜0.05）。

表2 麥麩、發酵麥麩及小麥粉中AX溶解性及分支度Table 2 Solubilization and branch degree of arabinoxylan in wheat bran, fermented wheat bran and wheat fl our

如表2所示，麥麩和發酵麥麩中AX含量分別為11.82 mg/g和10.48 mg/g，遠高于小麥粉（1.76 mg/g）。發酵麥麩中WEAX含量是麥麩的2.96 倍，這與圖1中趨勢保持一致，但是離子色譜法和間苯三酚法測定結果有明顯差異。盡管小麥粉中AX含量遠低于麥麩，但小麥粉中WEAX含量為1.46 mg/g，顯著高于麥麩（P＜0.05）。AX分子中阿拉伯糖與木糖的物質的量比通常以分支度形式表示，其比值越大說明木聚糖分子分支度越高。所有WEAX中分支度都小于AX，即證實了WEAX分支度低于WUAX。就AX而言，麥麩中分支度（0.85）顯著高于小麥粉（0.66），而對于WEAX，兩者分支度相當，說明麥麩中WEAX分支度與小麥粉相當，但WUAX分支度遠高于小麥粉。麥麩發酵后，AX和WEAX的分支度都明顯下降，說明發酵過程中WUAX和WEAX都發生了降解。

2.3 面包制作過程中游離酚及WEAX含量變化

表3 面團攪拌、醒發及烘焙后游離酚及WEAX含量變化Table 3 Changes in total phenols and WEAX contents after dough mixing, fermentation and bakingmg/g

盡管發酵麥麩中游離酚含量顯著高于麥麩（圖1），由表3可知，攪拌后，麥麩面團和發酵麥麩面團中游離酚含量沒有顯著差異（P＞0.05），而木聚糖酶麥麩面團和復合麥麩面團中游離酚含量分別為0.81 mg/g和0.96 mg/g，可能是添加的木聚糖酶對面團攪拌過程中酚類化合物釋放的貢獻較大。面團醒發及烘焙后，游離酚含量進一步增加，這是微生物來源酶、麥麩內源酶及木聚糖酶共同降解細胞壁的結果[25]。從攪拌到烘焙冷卻，發酵麥麩面團和復合麥麩面團中游離酚含量增幅達到100%，而麥麩面團和木聚糖酶麥麩面團增幅較小，說明相比木聚糖酶，發酵處理對麥麩中游離酚釋放貢獻更大。

由表3可知，攪拌后，木聚糖酶麥麩面團和發酵麥麩面團中WEAX含量比麥麩面團高出36%和45%，復合麥麩面團中WEAX含量最高為6.68 mg/g，這說明麥麩發酵處理和木聚糖酶協同促進AX溶解。醒發后，面團中WEAX含量增加了11%～34%。烘焙冷卻后面包中WEAX含量進一步增加至6.09～9.73 mg/g，說明面團中的木聚糖酶在烘焙階段仍保持活力。Dornez等[26]發現嗜熱菌株（棘孢曲霉）來源的木聚糖酶在面團烘焙初期保持較高活力，AX繼續溶解，面包比容明顯提升。然而，周素梅等[27]認為高溫使木聚糖酶失活且可利用的WUAX底物不足，WEAX含量不再增加；Verjans等[28]卻認為烘焙過程中部分WEAX會與其他組分通過化學鏈接或物理纏繞變得不可溶。產生這些差異的主要原因是木聚糖酶耐熱性和抑制敏感性不同。

2.4 麥麩面包中木聚糖組成

表4 發酵麥麩對面包中木聚糖溶解性及分支度的影響Table 4 Effects of fermented wheat bran on solubilization and branch degree of arabinoxylan in bread

如表4所示，面包中AX含量范圍是3.29～3.58 mg/g，且面包組間不存在顯著差異（P＞0.05）。麥麩面包和木聚糖酶麥麩面包中WEAX含量相當，這與Messia等[16]研究結果保持一致，且顯著低于發酵麥麩面包和復合麥麩面包，這可能是因為發酵前后麥麩的組成差異（圖1）及發酵麥麩中的天然酶在面包制作過程中持續發生作用（表3）。Messia等[16]同樣采用離子色譜法，測定的酸面團面包中WEAX含量高達3.1 mg/g，遠高于本研究中的發酵麥麩面包（1.44 mg/g），這與菌株特性、發酵參數及面包制作工藝等有關。

與麥麩、發酵麥麩及小麥粉中AX結構相似，面包中AX分支度明顯高于WEAX。麥麩面包和木聚糖酶麥麩面包中的AX分子（包括WUAX和WEAX）分支度相近，發酵麥麩面包和復合麥麩面包中的AX分子分支度相近。這說明相比木聚糖酶，發酵處理對麥麩面包中WUAX和WEAX分子分支度影響更大。就AX而言，麥麩面包和木聚糖酶麥麩面包的分支度顯著高于發酵麥麩面包和復合麥麩面包，而對于WEAX剛好相反，這說明發酵麥麩更傾向于降解WUAX，生成大分支度的WEAX；而木聚糖酶更大程度降解了WEAX。周素梅等[27]認為高品質的烘焙木聚糖酶通常能夠有效降解WUAX，且WEAX不被過度降解。因此認為馬克斯克魯維酵母發酵處理能夠有效提高麥麩在面包中的應用性能。

2.5 麥麩面包中酚類化合物消化吸收

表5 發酵麥麩對腸胃中游離酚消化吸收效果的影響Table 5 Effect of fermented wheat bran on in vitro digestibility and absorption of free phenolics in bread

未消化的麥麩面包中游離酚含量分別為1.33 mg/g（麥麩面包：樣品麥麩面團烘焙后）和1.26 mg/g（木聚糖酶麥麩面包：樣品木聚糖酶麥麩面團烘焙后），顯著低于發酵麥麩面包（樣品發酵麥麩面團烘焙后）和復合麥麩面包（樣品復合麥麩面團烘焙后），其含量分別為1.82 mg/g和1.91 mg/g（表3）。如表5所示，胃消化后，酚類化合物進一步被釋放，面包中游離酚含量范圍為3.86～6.32 mg/g，其中復合麥麩面包中游離酚含量顯著高于木聚糖酶麥麩面包和發酵麥麩面包，這說明發酵處理及木聚糖酶協同促進胃液中酚釋放。Liyana-Pathirana等[29]發現，經過胃液消化，硬麥粉樣品中游離酚含量增加1.36～4.13 倍，這是由于胃液酸性環境及水解酶活力雙重作用破壞了酚與其他組分間（如蛋白質和木聚糖等）的化學鍵，釋放出游離酚。經過腸道消化后游離酚含量有所下降，面包中游離酚含量為3.00～5.06 mg/g。Argyri等[30]發現紅酒經過腸道消化后游離酚有所損失，蘋果經過腸道消化后游離酚含量也顯著降低（P＜0.05）。麥麩面包中游離酚吸收量最低為0.74 mg/g，發酵麥麩面包和復合麥麩面包吸收液中游離酚含量也只有為0.86 mg/g和0.99 mg/g，可能是因為大量酚類化合物分子質量較大，難以透過透析袋，此外部分酚與其他組分連接形成大分子質量的聚合物。

表6 發酵麥麩對腸胃中阿魏酸消化吸收效果的影響Table 6 Effect of fermented wheat bran on in vitro digestibility and absorption of ferulic acid in bread

如表6所示，未消化面包中游離阿魏酸含量非常低（7.04～8.11 μg/g），這是因為阿魏酸多以結合態形式存在難以被甲醇提取[31]，Liyana-Pathirana等[29]認為小麥粉中本身不含游離阿魏酸。胃消化后，面包中阿魏酸含量增加1.91～2.18 倍，而Liyana-Pathirana等[29]研究中，胃液消化后硬麥粉樣品中游離阿魏酸含量僅增加1.40%～55.56%。與游離酚相似，腸道消化后面包中游離阿魏酸含量下降至17.98～20.87 μg/g，且復合麥麩面包中阿魏酸含量最高。腸消化液中67.80%～72.30%阿魏酸都被吸收，這說明阿魏酸吸收率普遍較高。Rondini等[32]認為腸道中酚酸吸收是一個緩慢而持續的過程，且結合狀態的酚酸生物利用效果優于游離狀態；Nordlund等[5]發現結腸吸收阿魏酸主要集中在發酵前2 h，但整個吸收過程持續24 h以上。

2.6 麥麩面包抗氧化活性

由圖2可知，相比麥麩面包，木聚糖酶麥麩面包的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力分別增加16.67%和22.92%，這是因為WEAX也具有一定的抗氧化活性。研究表明[9]擠壓改性后的麥麩中可溶性多糖含量增加1.7 倍，自由基清除能力和還原力也顯著提高（P＜0.05）。相比麥麩面包和木聚糖酶麥麩面包，添加發酵麥麩的面包（發酵麥麩面包和復合麥麩面包）具有更強的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力，這是因為麥麩發酵處理釋放出更多的游離酚酸（圖1）。陳中偉等[7]分別用堿和酶水解麩皮的外皮層、中間層和糊粉層發現各層酚酸組成和含量差異較大，且水解物抗氧化強度與游離酚酸含量呈正相關；且曾嵐等[33]研究發現麥麩的抗氧化能力與游離阿魏酸含量密切相關。整體而言，麥麩面包抗氧化能力大小為復合麥麩面包＞發酵麥麩面包＞木聚糖酶麥麩面包＞麥麩面包，這與面包中游離酚酸和WEAX含量直接相關。

3 結 論

麥麩發酵過程中（0～24 h），WEAX含量從8.01 mg/g上升至25.89 mg/g；游離酚和阿魏酸含量分別增加了73%和234%。麥麩中未檢測到游離阿拉伯糖，發酵麥麩中游離阿拉伯糖、葡萄糖和果糖含量分別增加至0.39、18.96、24.94 mg/g。離子色譜結果顯示：發酵麥麩中WEAX含量分別是麥麩和小麥粉的2.96 倍和1.84 倍，發酵麥麩中AX與WEAX的分支度低于麥麩，這說明發酵過程中WUAX和WEAX都發生了降解；發酵麥麩面包和復合麥麩面包中WEAX含量分別為1.44 mg/g和1.49 mg/g，顯著高于麥麩面包和木聚糖酶麥麩面包（P＜0.05）；含有發酵麥麩的面包中AX降解生成大量高分支度的WEAX。麥麩面包制作過程中，游離酚和WEAX含量持續增加，尤其是復合麥麩面團效果最明顯。胃、腸消化后發酵麥麩面包和復合麥麩面包中游離酚含量均高于麥麩面包和木聚糖酶麥麩面包，其中復合麥麩面包中游離酚吸收量高達0.99 mg/g。胃、腸消化后67.80%～72.30%阿魏酸被吸收，且發酵麥麩面包和復合麥麩面包吸收量最高。此外，發酵麥麩顯著提高了面包的抗氧化活性。將發酵麥麩作為功能配料應用到面包中，有望制得營養豐富、抗氧化活性強的高膳食纖維面包。