4-HR 與抗壞血酸對中華管鞭蝦多酚氧化酶的抑制動力學模擬分析

周宇芳，胡建坤，郝云彬，相興偉，楊會成，鄭 斌,*，肖金星

（1.浙江省海洋開發研究院，浙江 舟山 316100；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.浙江大學舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316100）

我國是蝦類養殖與捕撈大國，總產量位列全球首位，其中海水蝦占比56%以上，是我國大宗出口水產品之一[1-2]。海水蝦味美肉嫩，營養豐富，深受消費者青睞，在我國水產食品中占有支柱地位。由于體內水分、蛋白質等含量高，蝦類在捕撈、運輸、加工及貯藏過程中容易腐敗變質，尤其是極易發生黑變[3]。海水蝦黑變的發生是由于表面酪氨酸或其衍生物等色原物質在多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）的作用下經過一系列生化反應最終產生黑色素[4]，嚴重影響產品感官品質，制約其商品價值。因此，保持蝦的色澤和鮮度成為海水蝦產業的關鍵技術，保鮮防黑變技術的研發對于保證原料品質、避免經濟損失意義重大。

目前，我國普遍采用二氧化硫產生物（亞硫酸鹽），其能將黑色素形成過程的中間產物醌還原成無色化合物（雙酚），從而有效防止蝦類黑變[5]。但是，亞硫酸鹽添加到食品中存在嚴重的安全性問題，聯合國糧農組織和世界衛生組織以及美國、日本、歐盟等國家都嚴格規定蝦肉中SO2殘留不得超過0.1 mg/g[6]。近年來，國內外學者在蝦類防黑變生物保鮮劑的開發方面進行了部分研究，但是主要集中在中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）等不同品種蝦類PPO的制備與生化特征分析[7-9]、不同抑制因子效果評價[10-12]及復合抑制劑產品開發[13-14]等方面，缺乏對抑制功效成分作用機理的系統研究。分子動力學模擬是一種在原子水平上理解分子運動細節的方法[15]，可以直觀給出反應體系在一定溫度條件下的結構變化等，是研究酶催化機理的有效方法[16]。因此，可應用分子動力學模擬預測推斷抑制因子對PPO的抑制機理。

本實驗針對團隊前期開發的海水蝦無硫復合抑制劑主要功效成分4-己基間苯二酚（4-hexylresorcinol，4-HR）與抗壞血酸，開展2 種抑制因子的抑制效果及抑制類型研究，同時從抑制因子化學結構及動力學模型出發分析推斷其抑制機理，為綠色、高效的海水蝦防黑變產品的應用推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮中華管鞭蝦購自舟山國際水產城碼頭，加冰運回實驗室后，－80 ℃超低溫暫存。

L-抗壞血酸（食品級），4-HR、3-（3,4-二羥基苯基）-L-丙氨酸（3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine，L-DOPA）（均為分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；丙酮、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無水硫酸銨（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

IKA T10組織勻漿機 艾卡（廣州）儀器設備有限公司；UV2300紫外-可見分光光度儀 上海天美科學儀器有限公司；CT14RD冷凍離心機 上海天美生化儀器設備工程有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電氣有限公司；DHG-9076A恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；BSA224S分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；FE28-Stan pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海水蝦PPO的制備

采用Xiang Xingwei等[7]的方法，進行PPO的制備。

1.3.2 PPO活力的測定

參照Nirmal等[17]的方法并略有改進。以L-DOPA為特異性底物，將1 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）與1.2 mL 15 mmol/L L-DOPA混合均勻，45 ℃預熱3 min，然后加入45 ℃預熱3 min的待測酶液200 μL，混勻后立即在波長475 nm處測定吸光度變化，測定6 min，每1 min吸光度增加0.001定義為1 個酶活力單位。

1.3.3 抑制因子對PPO酶促反應的影響

反應體系中依次加入45 ℃預熱過的1.2 mL 15 mmol/L L-DOPA、1 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）、100 μL不同濃度的抑制因子和200 μL酶液，2 種抑制因子在反應體系中的終濃度如下：4-HR分別為0.01、0.03、0.05、0.10 mmol/L，抗壞血酸分別為0.5、1.0、2.0、2.5 mmol/L，酶活力測定方法同1.3.2節，空白對照組以100 μL超純水代替抑制因子。酶被抑制因子處理前后酶活力變化以剩余酶活力表示。酶促反應體系達到穩定態后，吸光度隨時間延長的線性段直線外推得到的橫截距為遲滯時間。

1.3.4 抑制因子對PPO的抑制類型和抑制常數

以L-DOPA為底物，在不同底物濃度條件下，測定不同濃度的4-HR與抗壞血酸的PPO活力抑制效果。通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖，以底物濃度的倒數為X軸，反應速率的倒數為Y軸，判斷不同抑制劑的抑制類型。抑制常數的測定是通過直線的斜率和縱軸截距對抑制劑濃度二次作圖，得到抑制劑對游離酶的抑制常數（KI）。

1.3.5 2 種抑制因子作用過程的化學動力學模擬分析

采用ChemBioOffice Ultra軟件，利用分子動力學模型MM2力場，基于量子化學的分子動力學計算方法對酶抑制反應路徑進行多次模擬優化，利用密度泛函理論計算各反應路徑中穩態和過渡態的結構和能量，并對分子模擬結果進行驗證[18-21]。通過以上分子動力學模擬分析，預測各抑制動力學流程及產物結構變化特征，探討2 種抑制因子的抑制機理。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，采用Excel 2007軟件繪圖。采用ChemBioOffice Ultra軟件進行分子動力學模擬計算，并繪制反應流程圖及結構變化示意圖。

2 結果與分析

2.1 2 種抑制因子對中華管鞭蝦PPO酶促反應的影響

圖1 4-HR（A）和抗壞血酸（B）對中華管鞭蝦PPO活力和遲滯時間的影響Fig. 1 Effects of 4-HR (A) and ascorbic acid (B) on the relative activity and the lag time of PPO

由圖1A可知，4-HR對PPO活力有明顯的抑制作用。隨著4-HR濃度的增加，PPO的剩余酶活力逐漸降低，半抑制濃度為0.072 mmol/L。同時，4-HR使PPO酶促反應的發生產生一定的延滯，遲滯時間隨4-HR濃度的增加而顯著延長（P＜0.05）。4-HR對PPO的延滯可能是4-HR與底物競爭性地與酶結合，產生無色物質，阻止黑變的發生。由圖1B可以看出，抗壞血酸對PPO的抑制作用明顯，其抑制作用及遲滯時間隨抗壞血酸濃度的增加而增大（P＜0.05），半抑制濃度為2.02 mmol/L，遠高于4-HR，說明4-HR對中華管鞭蝦PPO的抑制作用能力更強，與Leekim等[22]研究結果一致。

2.2 2 種抑制因子對海水蝦PPO的抑制類型

圖2 不同濃度4-HR（A）和抗壞血酸（B）處理的中華管鞭蝦PPO的Lineweaver-Burk圖Fig. 2 Lineweaver-Burk plots for PPO in the presence of different concentrations of 4-HR (A) and ascorbic acid (B)

圖2 為1 組縱軸截距不變的直線，說明4-HR與抗壞血酸不改變酶促反應的最大反應速率（Vmax），只影響米氏常數（Km），Km隨著抑制劑濃度的增加而增大，表明4-HR、抗壞血酸對中華管鞭蝦PPO的抑制作用均為競爭性抑制，說明2 種抑制因子同底物競爭性地與酶結合。

大多數PPO的競爭性抑制劑與底物在結構上有一定的相似性[23]。4-HR是間苯二酚的衍生物，結構與PPO底物鄰苯二酚相近。在底物存在的情況下，4-HR苯環上羥基與氧化態酶的活性中心部位競爭性結合[24]，從而減少酶與底物的接觸濃度，降低其催化效率，抑制黑變的發生。這與Alvarez-Parrilla[25]和Galv?o[26]等研究4-HR黑變抑制作用結果一致。以不同抑制劑條件下測定的Km對抑制劑濃度作圖，從直線斜率可求得4-HR對PPO的抑制常數KI為0.022 mmol/L。

關于抗壞血酸的抑制作用目前有2 種推測，一般認為它們是通過將PPO氧化中間產物鄰苯醌還原為鄰苯二酸和脫氫抗壞血酸以阻止黑色素生成[27-29]；Ali[30]和Arias[31]等研究認為，抗壞血酸除了能直接還原醌類化合物，其也可以通過與PPO活力中心結合，直接對PPO產生抑制作用，圖2B實驗結果也佐證了這一觀點。不同抑制劑條件下測定的Km對抑制劑濃度作圖，從直線斜率可求得抗壞血酸對中華管鞭蝦PPO的抑制常數KI為1.388 mmol/L。

2.3 2 種抑制因子作用過程的化學動力學模擬分析

2.3.1 4-HR抑制反應的模擬分析

圖3 4-HR抑制PPO動力學模型流程圖Fig. 3 Schematic illustration of PPO inhibition by 4-HR

PPO是多亞基的含銅金屬酶，每個亞基含2 個金屬銅離子，2 個金屬銅離子分別與蛋白質分子中2 個平展的組氨酸和1 個弱的直立組氨酸配體結合，另有1 個內源橋基將2 個銅離子聯系在一起，構成PPO催化氧化反應活性中心[32]（圖3中還原態酶）。4-HR是間苯二酚的衍生物，采用MM2力場模擬關鍵結合部位分子-原子之間的動力學關系，預測4-HR與PPO的抑制反應流程如圖3所示。經計算，中間產物1、2、3、4和5的結合能分別為445、463、122、127 kcal/mol和1 003 kcal/mol，化合物3和化合物4的能量急劇降低，化學反應更易發生，誘導反應向抑制方向發展，而化合物5能量極高，不能分解再次得到初始產物脫氧態酶。

根據4-HR抑制過程的分子結構化學動力學模擬結果，推測4-HR的抑制機理為：酚還原態酶（銅離子態）在氧氣的作用下，以過氧鍵結合并聯結2 個銅離子形成配位鍵占據銅離子的2 個赤道面位置，并作為銅離子之間的橋聯配體，形成酚氧化態酶（化合物1），構型由平面四邊形轉變為三角雙錐型，如圖4所示。4-HR苯環間位羥基上的氧原子作為親核試劑進攻酚氧化態酶上的銅離子，絡合成四角雙錐型構型的配位體（化合物2）。因四角雙錐結構的存在，氧氧鍵受σ*受體作用而帶有較少的負電荷，而π電子受體與氧氧鍵的σ*軌道上的電子作用，削弱了氧氧鍵，氧原子發生遷移，導致四角雙錐結構轉變成更穩定的三角雙錐型結構（化合物3）。在酸性條件下，化合物3脫去鄰苯三酚形成具有平面四邊形結構化合物4。因化合物5結合能很高（1 003 kcal/mol），形成后體系很穩定，故化合物4與4-HR結合進入一條幾乎死循環途徑，不參與正常產物的生成，破壞了PPO的循環催化路徑，阻止了PPO與底物的結合，降低其催化效率，抑制黑變發生。

圖4 4-HR催化體系結構變化示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the structural changes of 4-HR-inhibited catalytic system

2.3.2 抗壞血酸抑制反應的模擬分析

圖5 抗壞血酸抑制PPO動力學模型流程圖Fig. 5 Schematic illustration of PPO inhibition by ascorbic acid

抗壞血酸分子結構中存在4 個羥基，分別是芳環上2 個羥基，內側支鏈上1 個羥基，外側支鏈上2 個羥基。假設4 個羥基分別與PPO活力中心絡合，根據分子力場軌道理論，采用薛定諤方程對穩態的最小能量進行計算，預測其抑制機理如圖5所示。芳環上2 個羥基與活性中心結合的最小靜態穩定能量分別為461 kcal/mol和463 kcal/mol，內側支鏈上羥基與活性中心絡合的能量為1 116 kcal/mol，外側支鏈上羥基與活性中心絡合的最小靜態穩定能量為473 kcal/mol，這表明，內側上羥基空間位與活性中心的靜態穩定能量很高，生成的化合物不穩定。芳環上氧的σ*孤對電子，受芳環上π電子共軛作用，活性較高，與PPO的靜態穩定能更低，生成的化合物更穩定。而這一能量數值與底物鄰苯二酚（463 kcal/mol）幾乎一致，表明抗壞血酸的抑制作用與鄰苯二酚的促進作用可構成直接競爭關系。而在后續反應中，抗壞血酸的結合能更高，生成更穩定的PPO絡合物，降低了PPO與底物的接觸濃度，阻止了原雙酚催化循環的發生，從而發揮出防黑變作用。

3 結 論

4-HR、抗壞血酸均能抑制中華管鞭蝦PPO活力。隨著2 種抑制因子濃度的增加，PPO活力不斷下降，其中，4-HR對PPO活力的抑制效果強于抗壞血酸。被不同濃度4-HR、抗壞血酸處理的PPO參加的反應體系，隨著底物濃度的增加，PPO的Km值逐漸增加，而反應體系Vmax趨于相等，符合競爭性抑制劑作用于酶的特點。4-HR、抗壞血酸與PPO雙銅活性中心的初始結合能量大小接近，均可與PPO活力中心結合發揮抑制效果。在反應過程中，4-HR與PPO會生成一種高穩定絡合物，持續有效地消耗PPO，降低酶與底物的接觸濃度，較大程度上抑制黑變。此外，推測抗壞血酸存在2 種作用機制，一方面能通過與PPO活力中心絡合，直接對PPO產生抑制作用，另一方面能通過還原中間產物醛類抑制黑色素的生成。