自由基氧化對豬肌球蛋白-醛類化合物吸附特性的影響

丁安子，朱 萌,2，喬 宇，汪 蘭，熊光權，吳文錦，廖 李，李 新，石 柳,*

（1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北省農業科技創新中心，湖北 武漢 430064；2.湖北工業大學，湖北 武漢 430064）

1993年，Decker等[1]第一次將蛋白質氧化的概念引入肉及肉制品加工體系，隨后肉制品中蛋白質氧化的研究引起國內外學者的廣泛關注。研究發現，蛋白質的氧化貫穿于肉制品加工貯運的整個過程，造成蛋白質功能特性（溶解度、黏度、凝膠性、乳化性和保水性）發生變化[2]，影響肉制品的最終品質。氧化對蛋白質功能特性的影響基于其對蛋白質構象的改變，包括氨基酸修飾[3]、肽鏈斷裂[4]、分子內/分子間交聯[5-7]以及解折疊（結構展開）[8]。在現代肉類食品加工體系中，產品風味是十分重要的評判標準[9]。風味感知取決于風味成分的濃度、閾值等，以及與食品組分（肉制品主要為蛋白質）間相互作用。在影響蛋白質與風味成分相互作用的各種因素中，蛋白質構象的改變是一個重要因素[10-11]。現有研究結果表明，溫度、pH值與鹽類均可通過改變蛋白質構象而影響蛋白質的風味吸附能力[12-16]。但由于氧化造成蛋白質構象的改變，進而影響其風味吸附能力的研究鮮見報道。

本實驗以豬肉為原料，采用FeCl3/抗壞血酸/H2O2羥自由基氧化體系對豬肌球蛋白進行模擬氧化，探討自由基氧化對肌球蛋白結構變化及對醛類化合物吸附特性的影響，以期對肉類食品風味改進及加工貯存過程中風味控制和產品改良提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用4～5 月齡的閹割的長白公豬（96±5）kg，宰后2 h內取豬后腿股二頭肌肌肉去除結締組織和脂肪后絞碎，真空包裝后貯存于－20 ℃冰箱內備用。

BCA蛋白濃度測定試劑盒 碧云天生物技術研究所；3-甲基丁醛、戊醛、庚醛、辛醛（色譜純，純度＞98%） 國藥集團生物有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ALPHA 1-4 LD plus冷凍干燥機 德國Christ 公司；inVia-Reflex拉曼光譜儀 法國Renishaw公司；SpectraMax 190全波長酶標儀 美國MD公司；57330U固相微萃取裝置、57318萃取頭 美國Supelco公司；QP2010氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；WH966旋渦混合器 上?？等A生化儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白提取與純化

參照呂彤等[12]的方法。取肌肉100 g，加入6 倍體積6 mmol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液（pH 6.9），在冰上高速勻漿3 次，每次6 s，間隔10 s，然后低溫離心（11 500×g、10 min、4 ℃）。收集沉淀，再次加入6 mmol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液（pH 6.9）勻漿、離心（11 500×g、10 min、4 ℃）并收集沉淀，重復3 次。取沉淀加入2 倍體積0.675 mol/L KCl溶液（含7.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），7.5 mmol/L ATP，pH 6.4）抽提10～12 min，然后低溫離心（11 500×g、10 min、4 ℃）。收集上清液，用9 倍體積預冷后的蒸餾水稀釋并低溫離心（11 500×g、10 min、4 ℃），所得沉淀用1/5體積的0.12 mol/L Tris-maleate緩沖溶液（含3 mol/L KCl、0.6 mmol/L DTT，pH 7.5）溶解，再加入1/10體積的含110 mmol/L ATP和55 mmol/L MgCl2，5.5 mmol/L EGTA的溶液（pH 7.5）后，用質量分數40%～55%的(NH4)2SO4飽和溶液分離，所得沉淀即為粗肌球蛋白。

用20 mmol/L Tris-maleate緩沖液（含0.5 mol/L KCl、0.1 mmol/L DTT，pH 7.5）溶解沉淀并透析過夜，－50 ℃冷凍干燥48 h，即得純化的肌球蛋白。

1.3.2 肌球蛋白氧化處理

采用芬頓氧化體系：其中FeCl3濃度為0.1 mmol/L，抗壞血酸濃度為1 mmol/L，H2O2濃度分別為0、1、5、10、20 mmol/L。

采用50 mmol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0）調整肌球蛋白質量濃度為20 mg/mL。將肌球蛋白溶液與氧化體系等體積混合，混合液在2 ℃條件下避光氧化24 h。為減少氧化反應試劑對后續實驗的影響，將氧化后的肌球蛋白裝入透析袋，以20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0）為透析液，于4 ℃條件下透析過夜。將透析后的肌球蛋白溶液冷凍干燥，貯存于－20 ℃冰箱中備用。

1.3.3 巰基總量及活性巰基含量測定

參照Hamada等[17]的方法，略作修改。采用20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0）調整肌球蛋白質量濃度為4 mg/mL。取0.75mL肌球蛋白溶液，加入2.25 mL 8 mol/L尿素，使尿素終濃度為6 mol/L；向混合液中添加20 μL 1.5 mg/mL二硝基苯甲酸，25 ℃孵化5 min，在412 nm波長處測定吸光度，空白組為不加蛋白質而含緩沖液的混合體系。巰基含量計算如式（1）所示：

式中：A為減去試劑空白后412 nm波長處蛋白吸光度；D為蛋白稀釋倍數；C為蛋白質量濃度/（mg/mL）；ε為摩爾消光系數（13 600 L/（mol·cm））。

1.3.4 肌球蛋白二級結構測定

參照Alix等[18]的方法，略作修改。取1 g冷凍干燥后的肌球蛋白樣品，選用20 倍長聚焦鏡頭聚焦測試。具體條件為：532 nm氬離子激光器，功率12 mW，分辨率1 cm－1，收集180°散射光，掃描范圍500～2 100 cm－1，每個樣品掃描30 次。數據處理采用Labspec軟件對結果譜圖進行基線校正及平滑處理，以苯丙氨酸的單基取代苯基環在1 003 cm－1伸縮振動強度作為內標進行歸一化。蛋白質二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲及其他結構）含量計算參考Susi等[19]的方法，利用PeakFit 4.12軟件結合傅里葉去卷積處理進行曲線擬合定量分析蛋白質酰胺I帶。

1.3.5 表面疏水性測定

參照Boyer等[20]的方法。采用20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0）調整肌球蛋白質量濃度為1 mg/mL，以8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）為熒光探針，取6.5 μL 0.8 mmol/L的ANS添加到200 μL肌球蛋白溶液中。激發波長380 nm，發射波長475 nm，激發和發射波長的狹縫均設定為5 nm，用全波長酶標儀測定熒光強度。以未處理的肌球蛋白作為對照，疏水強度用處理組蛋白與對照組蛋白熒光強度的比例（相對熒光強度）表示，計算如式（2）所示：

1.3.6 醛類化合物標準溶液制備及固相微萃取-GC/MS測定

將3-甲基丁醛、戊醛、庚醛、辛醛4 種醛類化合物分別用少量乙醇溶解，然后用純水定容至各化合物質量濃度為1 mg/mL，即得醛類化合物標準溶液，貯存于4 ℃冰箱中備用。

采用20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0）將純化及自由基氧化處理后的豬肉肌球蛋白溶解，調整質量濃度為1 mg/mL。精確吸取5 mL蛋白溶液至20 mL頂空瓶中，然后添加醛類化合物標準溶液并調整其質量濃度為1 μg/mL，置于4 ℃振動平衡16 h后，選用75 μm CAR/PDMS萃取頭在25 ℃頂空吸附40 min后氣相色譜進樣。

色譜條件：色譜柱：v o c o l毛細管柱（60 m×0.32 mm，0.18 μm）；程序升溫：初始溫度35 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至40 ℃，再以5 ℃/min 升至210 ℃，保持15 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為He，流量1 mL/min。

質譜條件：電子電離源溫度200 ℃；電子電離能量70 eV；質量掃描范圍45～600 u。各風味成分的質譜數據與NIST、WILEY7.0進行比對定性，對鑒定化合物進行峰面積歸一化定量分析。

蛋白質-醛類化合物作用強弱，參照周昌瑜等[13]的方法，用溶液中化合物自由比例表示，計算如式（3）所示：

式中：As為蛋白樣品溶液中醛類化合物的峰面積；Ac為空白溶液中醛類化合物的峰面積。

1.4 統計分析

采用SAS 8.0中one-way ANOVA的Duncan’s Multiple Range Test模型序進行統計學分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 肌球蛋白巰基總量和活性巰基含量分析

圖1 H2O2處理濃度對肌球蛋白巰基總量和活性巰基含量的影響Fig. 1 Effect of H2O2 concentration on total and reactive sulfhydryl contents of myosin

如圖1所示，隨著H2O2處理濃度的增加，巰基總量整體呈降低趨勢，當H2O2濃度在0～5 mmol/L范圍時，處理組巰基總量顯著降低（P＜0.05），在10～20 mmol/ L范圍時，巰基總量變化不顯著（P＞0.05）；活性巰基含量呈顯著降低趨勢（P＜0.05），與李艷青等[21]的研究結果一致。

半胱氨酸殘基中的巰基是蛋白質中最活潑的基團，也是抗氧化活性最強的基團[22]，其含量的變化可反映蛋白質氧化情況[23]。肌球蛋白分子中約含有40 個半胱氨酸殘基，其中27 個分布在肌球蛋白頭部S1亞基上，13 個分布在螺旋狀桿部（Rod）上[24]。處于氧化體系中時，S1亞基中的半胱氨酸殘基首先被氧化修飾，隨后Rod中巰基基團暴露于肌球蛋白表面，此時形成的分子內二硫鍵占主導；隨著H2O2處理濃度的繼續增加，分子間二硫鍵大量生成，蛋白質發生交聯聚集[25]。

在本研究中，H2O2濃度在0～1 mmol/L之間時，活性巰基含量變化不明顯（P＞0.05），巰基總量顯著減少（P＜0.05）且遠大于活性巰基含量變化，說明蛋白結構被打開，肌球蛋白頭部S1亞基內部巰基首先暴露出來，同時蛋白表面巰基被氧化消耗，且暴露的量遠大于消耗的量；H2O2濃度在1～5 mmol/L之間時，巰基總量和活性巰基含量均顯著減少（P＜0.05），且活性巰基含量減少量約為巰基總量的1/2，說明蛋白結構進一步打開，蛋白內部巰基大量暴露；H2O2濃度在5～10 mmol/L之間時，巰基總量輕微上升（P＞0.05），活性巰基含量顯著減少（P＜0.05），肌球蛋白表面巰基被羥自由基氧化形成分子間二硫鍵，發生LMM-LMM交聯聚集[26]；H2O2濃度在10～20 mmol/L之間時，巰基總量輕微降低（P＞0.05），活性巰基含量顯著減少（P＜0.05），說明蛋白表面巰基進一步轉化為分子間二硫鍵，蛋白質交聯聚集加劇。

2.2 肌球蛋白二級結構分析

不同濃度H2O2處理的肌球蛋白峰擬合圖譜如圖2所示，肌球蛋白二級結構相對含量變化如表1所示：α-螺旋的相對含量先降低后升高，當H2O2濃度在0～5 mmol/L范圍時，處理組持續顯著降低（P＜0.05），在10 mmol/L時出現顯著升高（P＜0.05），與李春強等[27]的研究結果相似；β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的相對含量變化呈波動變化趨勢。

肌球蛋白主要由α-螺旋結構構成[28]，受到羥自由基的攻擊時，其α-螺旋結構失去穩定引起蛋白質構象的改變。在本研究中，H2O2濃度在0～1 mmol/L之間時，α-螺旋結構相對含量降低（P＜0.05），β-折疊相對含量升高（P＜0.05）。肌球蛋白受到氧化劑的攻擊后，頭部S1亞基展開，α-螺旋結構失去穩定，分子內氫鍵減少，多肽鏈上羰基（C＝O）和氨基（N—H）與相鄰肽鏈上的C＝O和N—H之間形成分子間氫鍵，造成β-折疊相對含量升高。H2O2濃度在1～5 mmol/L之間時，α-螺旋結構與β-折疊結構相對含量均降低（P＜0.05），此時蛋白結構進一步打開，分子內氫鍵繼續減少，同時巰基氧化生成分子內二硫鍵，肽鏈結構發生回折，β-轉角相對含量顯著升高（P＜0.05）。H2O2濃度在5～10 mmol/L之間時，α-螺旋結構與β-折疊結構相對含量升高（P＜0.05），這是由于氧化劑誘導肌球蛋白分子通過二硫鍵發生LMM-LMM共價交聯；H2O2濃度在10～20 mmol/L之間時，α-螺旋結構相對含量降低，但不顯著（P＞0.05），β-折疊結構相對含量降低（P＜0.05），β-轉角相對含量升高（P＜0.05），說明LMM-LMM共價交聯加劇，肽鏈結構發生回折。

Bourassa[29]、Ahmed-Ouameur[30]等分別研究了牛血清蛋白和人血清蛋白與多種藥物小分子間相互作用，結果發現藥物小分子的添加均可導致α-螺旋結構相對含量的降低，其原因是蛋白質的C＝O、C—N和N—H基團與藥物小分子間形成氫鍵相互作用[31-32]。因此，隨著肌球蛋白結構的展開，α-螺旋結構相對含量降低，分子內氫鍵作用減小，分子間氫鍵作用增大。

圖2 肌球蛋白經H2O2處理后的拉曼光譜擬合圖Fig. 2 Fitted Raman spectra of myosin treated with different concentrations of H2O2

表1 不同濃度H2O2處理的肌球蛋白二級結構的相對含量分析Table 1 Relative contents of secondary structures of myosin treated with different concentrations of H2O2 %

2.3 肌球蛋白表面疏水性分析

圖3 H2O2處理濃度對肌球蛋白表面疏水性的影響Fig. 3 Surface hydrophobicity of myosin treated with different concentrations of H2O2

如圖3所示，隨著H2O2處理濃度的增加，肌球蛋白的表面疏水性整體呈上升趨勢。在本研究中，H2O2濃度在0～5 mmol/L之間時，表面疏水性顯著增加（P＜0.05），這是由于肌球蛋白頭部S1亞基在氧化過程中展開，內部疏水性氨基酸殘基暴露，表面疏水性增加，與Chanarat等[33]研究結果一致；H2O2濃度在5～10 mmol/L之間時，表面疏水性繼續增加，但不顯著（P＞0.05），此時蛋白質展開與聚集同時存在，蛋白質展開造成疏水性氨基酸殘基暴露，而蛋白質聚集造成疏水性氨基酸殘基掩埋；H2O2濃度在10～20 mmol/L之間時，表面疏水性顯著增加（P＜0.05），可能是由于強氧化條件下蛋白聚集部分屏蔽了蛋白展開的作用，蛋白聚集（主要是二硫鍵）導致的蛋白再折疊以及生成多聚物引起表面疏水性增加。

2.4 肌球蛋白的吸附作用分析

圖4 H2O2處理濃度對肌球蛋白吸附性的影響Fig. 4 Effect of H2O2 concentration on binding capacity between myosin and aldehyde compounds

如圖4所示，不同鏈長醛類化合物與未氧化處理蛋白吸附作用強度大小為：戊醛＜庚醛＜辛醛，隨化合物疏水性（鏈長）的增加而增大，這與Weel[34]、Tan[35]等對β-乳球蛋白、牛血清蛋白與醛類化合物相互作用研究結果一致。相同碳原子數醛類化合物吸附作用強度大小為：戊醛＜3-甲基丁醛，進一步證明隨化合物疏水性（支鏈＞直鏈）的增加，其與蛋白間相互作用增大。

Brewer等[36]指出，氫鍵作用和疏水相互作用是影響醛類吸附的主要作用。如圖4所示，肌球蛋白（1 mg/mL）被羥自由基氧化后，以3-甲基丁醛為例，H2O2濃度在0～5 mmol/L之間時，分子間氫鍵作用隨著α-螺旋的減少而持續增大，疏水相互作用也隨著疏水基團的暴露而顯著增大，從而造成蛋白對醛類化合物的吸附作用增強，化合物自由比例顯著降低（P＜0.05）；H2O2濃度在5～10 mmol/L之間時，疏水相互作用無顯著變化，但是分子間氫鍵作用隨著α-螺旋的增加而減小，此時蛋白對醛類化合物的吸附作用隨分子間氫鍵作用的減小而減弱，化合物自由比例顯著升高（P＜0.05）；H2O2濃度 在10～20 mmol/L之間時，雖然α-螺旋相對含量變化不明顯，但是深度氧化造成疏水基團暴露，以及蛋白交聯形成疏水性空腔，從而使疏水相互作用繼續增大，蛋白對醛類化合物的吸附作用增強，化合物自由比例顯著降低（P＜0.05）。其他醛類化合物與肌球蛋白吸附作用趨勢與3-甲基丁醛類似，由于不同醛類化合物的物理化學性質略有不同，其自由比例各自不同。

由此可見，H2O2濃度在0～5 mmol/L之間時，肌球蛋白以展開為主，其與醛類化合物間相互作用主要為氫鍵作用和疏水相互作用；H2O2濃度在10～20 mmol/L之間時，肌球蛋白以交聯聚集為主，其與醛類化合物間相互作用主要為疏水相互作用。

3 結 論

不同濃度H2O2氧化處理豬肌球蛋白，使氫鍵作用和表面疏水作用發生變化，改變了蛋白質構象，進而引起蛋白質對醛類化合物吸附能力的改變。低濃度H2O2處理條件下（0～5 mmol/L），肌球蛋白氧化以蛋白質展開為主，展開過程中α-螺旋失去穩定，分子內氫鍵轉化為分子間氫鍵，氫鍵作用增大，疏水性氨基酸殘基暴露，表面疏水性增加，疏水作用增大；高濃度H2O2處理條件下（10～20 mmol/L），蛋白以交聯聚集為主，交聯聚集過程中分子間二硫鍵大量生成，蛋白發生再折疊并生成多聚物，表面疏水性增加，疏水作用增大。肌球蛋白與醛類化合物間的作用力主要為氫鍵和疏水相互作用，氫鍵和（或）疏水相互作用越強，蛋白質對醛類化合物的吸附能力越強。