氧脂素對赭曲霉孢子產生、赭曲霉毒素A合 成及糧食受侵染程度的影響

高 婧，李彩艷,2，李可馨，彭夢雪，梁志宏,*

（1.中國農業大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.河南省食品藥品審評查驗中心，河南 鄭州 450000）

赭曲霉（Aspergillus ochraceus）是一種廣泛分布于糧食和飼料中的絲狀真菌，可以產生有害次級代謝產物赭曲霉毒素。目前已發現超過20 種赭曲霉毒素，其中赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）分布最廣、危害最大[1]。OTA廣泛污染谷物、豆類、葡萄、咖啡等農副產品[2]，可以引起人類和動物的肝臟、腎臟損傷，并有致畸、致突變、致癌和免疫抑制作用[3]，被國際癌癥研究機構列為2B類致癌物，在已知的真菌毒素中，OTA的危害性僅次于黃曲霉毒素[4]。中國、美國、加拿大、澳大利亞、日本、韓國等國家，以及國際食品法典委員會和歐盟等國際組織發布的有關食品中真菌毒素法規中都對OTA的限量標準做出了要求[5]。

近年來在莢膜組織胞漿菌（H i s t o p l a s m a capsulatum）[6]、構巢曲霉（Aspergillus nidulans）[7]、黃曲霉（Aspergillus flavus）[8]等真菌中發現，真菌能夠通過群體感應信號調控機制，調節其生長發育和真菌毒素產生。群體感應是微生物調節群體行為的信號交流機制，微生物可以生產特定的小分子物質（成為群體感應信號分子）并分泌到胞外，當胞外信號分子在局部環境中積累達到一定的水平時，可以進入其他微生物細胞內激活特定基因的表達，從而調控菌群生理功能，以適應周圍環境的改變[9-10]。群體感應機制在細菌中十分普遍，細菌通過群體感應機制控制其群體行為，如生物發光、毒力因子分泌和生物膜的形成等，從而在種群競爭中占據優勢[9]。霉菌中也存在類似于細菌群體感應的密度調節機制，黃曲霉[11]及赭曲霉[12]在侵染脂肪酸含量高的作物時更容易產生毒素，這表明脂肪酸類物質及其代謝產物可能參與了真菌群體感應的調控。

真菌中已發現的群體感應信號分子主要有氧脂素、法尼醇、γ-丁內脂[10]，其中氧脂素是多不飽和脂肪酸通過酶促或非酶促反應加氧產生的一類脂氧合物，是霉菌、酵母菌、植物和動物信號轉導途徑的重要信號分子，可以調節真菌的無性和有性發育之間的平衡，影響真菌毒素的合成[13]。植物來源的亞油酸氧化產物如羥基十八碳二烯酸（hydroxyoctadecaenoic acid，HODE）、氫過氧化十八碳二烯酸（hydroperoxyoctadecadienoic a c i d，H P O D E）和氫過氧化十八碳三烯酸（hydroperoxyoctadecatrienoic acid，HPOTE）等可以影響黃曲霉和構巢曲霉的營養生長、分生孢子、菌核的形成及真菌毒素的合成[14-15]。13S-HPODE和13S-HPOTE可以抑制黃曲霉毒素合成，9S-HPODE能夠促進黃曲霉毒素合成[16]，13S-HPODE可以促進分生孢子的產生而9S-HPODE可以促進子囊孢子的產生[17]。隨著群體密度的增加，黃曲霉逐漸實現從菌核到分生孢子的轉換，而當敲除黃曲霉的脂氧化酶基因lox后菌體不能正常產生氧脂素，當孢子接種密度大于105個/mL時菌核數目增加而分生孢子數目減少[18]。與黃曲霉類似，氧脂素也可以調節赭曲霉的形態和毒素產生，赭曲霉AoloxA基因產物脂氧合酶能夠催化亞油酸發生加氧反應，生成脂過氧化物9S-HODE和13S-HODE，影響赭曲霉形態及OTA的合成，Reverberi等[19]的實驗結果顯示，當敲除赭曲霉菌株的lox基因后，與野生型相比，突變的Delta AoloxA菌株氧脂素水平降低，形成的分生孢子數減少，菌核數目增加，OTA合成受到抑制。Punelli等[20]使用水楊基異羥肟酸和白藜蘆醇（一種脂氧合酶抑制劑）作用于赭曲霉菌株，發現脂肪氧合酶活性的降低導致OTA產量明顯減少，Antonioletti等[21]證明了能夠控制OTA生物合成的化合物也顯著抑制lox的活性。說明氧脂素在控制赭曲霉OTA生物合成中起主要作用。

赭曲霉的生長發育和OTA合成受到群體密度調控[12]，但具體的群體感應信號分子及其調控機制尚不明確，氧脂素可能是赭曲霉的群體感應信號分子之一。因此本實驗擬探究氧脂素9S-HODE和13S-HODE是否為赭曲霉群體感應信號分子及其對赭曲霉生長發育和OTA合成的作用，旨在闡明氧脂素在赭曲霉生長發育和毒素產生中所起的作用，豐富赭曲霉的毒素合成調控機理研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赭曲霉AS3.4412購自中科院微生物所，－80 ℃超低溫冰箱保存；小麥產自河南省洛陽市；玉米產自河南省焦作市；花生產自吉林省遼源市；大豆產自黑龍江省綏化市。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養基 北京索萊寶科技有限公司；赭曲霉毒A殘留酶聯免疫試劑盒 北京勤邦生物技術有限公司；吐溫20國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 美國J.T.Baker化學試劑有限公司；甲醇（色譜純） 中國賽默飛世爾科技有限公司；甲酸（色譜純） 北京化工廠；9S-HODE、13S-HODE 美國Cayman化學公司。

1.2 儀器與設備

Multiscan Ascent酶標儀 美國Thermo公司；恒溫培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司；5804R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；普通光學顯微鏡 南寧松景天倫生物科技有限公司；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；SANYO MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 江蘇省科學器材有限公司；1200-6410B高效液相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 赭曲霉在不同孢子接種密度下的液體培養

赭曲霉AS3.4412菌株活化后選取長勢較好的菌落，挑取少許菌絲，接種在PDA培養皿的中央，于霉菌培養箱28 ℃倒置培養6 d后，可觀察到PDA培養皿表面長滿赭色孢子，將孢子刮下置于0.9% NaCl（含0.01%吐溫20）中，紗布過濾后取孢子濾液。血球計數板計數后將孢子密度稀釋至107個/mL和104個/mL，取2.5 mL孢子懸液分別加入22.5 mL PDB培養基中，使得PDB液體培養基中孢子的最終密度分別為106個/mL和103個/mL，于28 ℃搖床培養，分別在培養的3、4、5、6 d取樣測定9S-HODE、13S-HODE和OTA含量。

1.3.2 赭曲霉PDA培養皿中氧脂素的添加

打孔器裁下直徑1 cm的圓形濾紙片后滅菌，將9S-HODE和13S-HODE標準品用乙醇稀釋，終質量濃度1 μg/mL，0.22 μm有機濾膜過濾除菌后浸透濾紙片，待其干燥后鋪在接種了赭曲霉孢子的平板中央。添加氧脂素的赭曲霉PDA培養皿于28 ℃培養6 d，觀察赭曲霉菌落形態，之后以濾紙片為中心，將濾紙片周圍直徑為3 cm范圍內的赭曲霉孢子刮下計數；另以濾紙片為中心，將濾紙片周圍直徑為3 cm范圍內的培養基取出，提取培養基中的OTA測定含量。

1.3.3 赭曲霉中氧脂素含量的測定

PDB液體培養基中分離赭曲霉菌絲球，于－80 ℃冷凍8 h后用真空冷凍干燥機干燥24 h。將凍干后的菌絲球在液氮中均質，用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液抽提菌絲球2 次，取氯仿層；在1 mL的氯仿的體系中加入2 mg三苯基膦作為抗氧化劑；氮氣吹干，500 μL甲醇重溶后過0.22 μm有機濾膜除去大顆粒雜質，采用高效液相色譜-質譜聯用儀測定氧脂素含量。

色譜條件：采用等度洗脫，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液90∶10（V/V）；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；色譜柱采用Agilent Eclipse plus C18柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm），柱溫30 ℃。

質譜條件：電噴霧離子源負離子模式；串聯四極桿質量分析器；離子源溫度100 ℃；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速8.0 min；霧化氣壓力35.0 psi；碎裂電壓為135 V；檢測方式選擇多重反應監測模式。

1.3.4 赭曲霉培養基中OTA含量的測定

采用酶聯免疫試劑盒法測定OTA含量。取液體培養基置于離心管中，調pH 1～2，加1 mL三氯甲烷混勻，10 000×g離心5 min后取下層有機清液于新的離心管，氮氣吹干后加1 mL甲醇復溶。酶聯免疫吸附法檢測OTA含量，根據需要量將濃縮酶結合物用結合物稀釋液稀釋，微孔中加入標準品/樣本，然后加入酶結合物工作液避光反應，去離子水洗板4～5 次，顯色5 min后加入終止液，最后使用酶標儀于波長450 nm處測定每孔OD值。

1.3.5 赭曲霉對種子的侵染

將選取的種子用7 5%乙醇溶液消毒1 m i n，0.05% NaClO溶液消毒3 min，無菌水沖洗數次，將種子用滅菌的的紗布擦干，置于三角瓶中。稱取200 g種子浸沒在200 mL無菌水（CK）或孢子懸浮液中，搖床200 r/min搖30 min，過濾后種子放入錐形瓶，于28 ℃培養箱暗培養7 d。

1.3.6 種子發芽率的計算

發芽率是指在規定的條件和時間內長成的正常幼苗數占供檢驗種子數的百分率。測定方法參照GB/T 3543.4—1995《農作物種子檢驗規程 發芽試驗》，隨機數取3 組試樣：花生、大豆、玉米種子以50 粒為一組（50×3），小麥種子以100粒為一組（100×3）。無菌水浸種24 h之后均勻排列在墊有兩層濾紙的培養皿中，將濾紙浸濕，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，花生、大豆、玉米、小麥的培養時間分別為5、5、4、4 d。種子發芽率的計算公式如下，結果用3 組實驗結果的平均值表示。

式中：M1為全部正常發芽粒數；M為供試種子粒數。

1.3.7 糧食營養成分的測定

為分析赭曲霉侵染糧食后，花生、大豆、玉米和小麥的營養成分損失情況，依據國標方法測定脂肪（GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》）、蛋白質（GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》）、VB1（GB/T 5009.84—2016《食品中維生素B1的測定》）、VE（GB/T 5009.82—2016《食品中維生素E的測定》）的含量。

1.4 統計分析

采用IBM SPSS V 20.0軟件分析實驗數據，平均值的差異性用單因素方差分析（one-way ANOVA）中的最小顯著性差異法檢驗分析，P＜0.05，差異顯著。數值用表示，實驗重復3 次。統計分析圖采用Microsoft Office Excel 2016繪制。

2 結果與分析

2.1 群體密度對赭曲霉的氧脂素和OTA產量的影響

為明確赭曲霉的群體密度對9S-HODE和13S-HODE及OTA產量的影響，測定赭曲霉在低密度群體（初始孢子接種密度103個/mL）和高密度群體（初始孢子接種密度106個/mL）中9S-HODE、13S-HODE和OTA的產量變化，結果如圖1所示。9S-HODE和13S-HODE分別可以促進和抑制黃曲霉中毒素的產生[22]，故用9S-HODE/13SHODE分析其對OTA產量的影響。

圖1 不同培養時間和接種密度對赭曲霉的氧脂素（A）和OTA產量（B）的影響Fig. 1 Effects of culture time and inoculum density on ochratoxin (A)and OTA yield (B)

低群體密度的赭曲霉所產9S-HODE/13S-HODE比值高于高群體密度的赭曲霉，并產生更多的OTA。接種后赭曲霉產生9S-HODE/13S-HODE的比值在不斷下降，初始接種密度為103個/mL的赭曲霉9S-HODE/13S-HODE比值開始時高于106個/mL的赭曲霉，隨培養時間的延長二者趨于一致（圖1A）。低群體密度赭曲霉的OTA產量高于高群體密度赭曲霉，隨培養時間的延長逐漸趨于一致（圖1B）。

在低群體密度（103個/mL）構巢曲霉中添加氧脂素，青霉素的產量提高[7]；在黃曲霉中添加脂氧合物13S-HPODE明顯抑制黃曲霉毒素合成，加入9S-HPODE促進黃曲霉毒素合成[23]。微生物產生特定的小分子化學物質并分泌到胞外，當胞外信號分子在局部環境中積累達到一定水平時，可以進入其他微生物細胞內激活特定基因的表達，從而調控群體行為適應環境的變化[16]，這種通過密度依賴機制調節生物行為的機制最早在細菌中發現，稱為群體感應。實驗推測在赭曲霉中氧脂素9S-HODE和13S-HODE作為信號分子調控OTA產量。

2.2 添加9S-HODE、13S-HODE對赭曲霉生長發育和OTA產量的影響

為進一步分析氧脂素對赭曲霉生長發育和OTA產生的影響，在赭曲霉PDA培養基中外源添加9S-HODE和13S-HODE，觀察赭曲霉菌落生長，測定產生的孢子數和OTA的產量。添加9S-HODE抑制赭曲霉菌落生長和孢子生成，促進OTA的產生；添加13S-HODE促進赭曲霉菌落生長和孢子生成，抑制OTA產生。觀察菌落數量和形態，添加乙醇的對照組未顯示出明顯的促進或抑制菌落生長的作用，添加9S-HODE的濾紙周圍菌落生長量最少，添加13S-HODE的濾紙周圍長出了較多菌落（圖2A）。計數結果與平板上觀察到的現象相符，孢子產量：13S-HODE組（7×107個）＞乙醇對照組（5×107個）＞9S-HODE組（4×107個），說明9S-HODE確實抑制赭曲霉孢子產生，13S-HODE促進赭曲霉孢子產生（圖2B）。測定OTA產量，9S-HODE組（90 ng/mL）＞乙醇對照組（60 ng/mL）＞13S-HODE組（35 ng/mL），表明9S-HODE可以促進OTA的產生，而13S-HODE可以抑制OTA的產生（圖2C）。

圖2 添加9S-HODE和13S-HODE對赭曲霉菌落生長（A）、孢子數（B）、OTA產量（C）的影響Fig. 2 Effects of addition of 9S-HODE and 13S-HODE on colony growth (A), spore number (B), and OTA production (C) of A. ochraceus

Brown等[8]研究發現，氧脂素作為群體感應的信號分子，調節黃曲霉生長發育和黃曲霉毒素產生。在黃曲霉培養基中外源加入13S-HPODE會抑制黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）合成，促進黃曲霉孢子產生；加入9S-HPODE會促進AF合成，抑制黃曲霉孢子產生[22]。氧脂素對赭曲霉與黃曲霉的生長發育和次級代謝產物影響類似，推測氧脂素作為赭曲霉的群體感應信號分子影響赭曲霉的生長發育和OTA產量，9S-HODE抑制赭曲霉孢子生成，促進OTA的產生；13S-HODE促進赭曲霉孢子生成，抑制OTA產生。

2.3 不同群體密度赭曲霉孢子侵染糧食規律

2.3.1 赭曲霉侵染對糧食發芽率的影響

為研究不同密度群體赭曲霉對花生、大豆、玉米、小麥等大宗農作物的侵染能力，測定赭曲霉侵染后的種子發芽率（圖3）。從被103、106個/mL的赭曲霉孢子懸浮液侵染的花生、大豆、玉米中挑選出種子50 粒，從小麥中挑出種子100 粒進行發芽實驗。侵染濃度106個/mL的赭曲霉比103個/mL的赭曲霉對糧食發芽的損傷更大。低密度赭曲霉侵染后花生、大豆、玉米、小麥發芽率分別下降了29%、21%、17%、14%；高密度赭曲霉侵染后花生、大豆、玉米、小麥發芽率分別下降了35%、29%、20%、22%，赭曲霉侵染可能對脂肪和蛋白質含量高的作物如花生、大豆的危害更大。脂類物質與氧脂素的生物合成有密切的關系，植物來源的亞油酸氧化產物可以影響曲霉的營養生長、分生孢子、菌核的形成及真菌毒素的合成[14-15]，赭曲霉對糧食的侵染可能受到氧脂素的調控。

圖3 花生、大豆、玉米和小麥被不同孢子密度赭曲霉侵染后的生長情況（A）和發芽率（B）Fig. 3 Growth (A) and germination rate (B) of peanut, soybean, corn and wheat infected with different spore densities of A. oryzae

植物氧脂素和曲霉屬真菌氧脂素在生理作用上有相似性，植物中催化脂肪酸形成氧脂素的酶是脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX），LOX的主要作用是催化含有順,順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸（如亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等）進行加氧反應，氧原子可添加在亞油酸碳氫鏈的第9或第13位的碳原子上，從而形成9S、13S脂肪酸氫過氧化物（9S-HPODE、13S-HPODE），它們影響黃曲霉侵染作物種子過程中黃曲霉的生長、孢子產生以及黃曲霉毒素的生物合成[24]。黃曲霉侵染玉米和花生種子，誘導種子中編碼9-LOX的基因表達上調，9S-HPODE含量增加，黃曲霉毒素產量增加[25]。發現黃曲霉侵染對脂肪含量高的作物危害更大，推測是作物本身產生的9S-HPODE會誘使黃曲霉產生更多的黃曲霉毒素，同時促進有性孢子產生[16]。本研究發現赭曲霉的侵染規律同黃曲霉，從另一個角度驗證氧脂素影響赭曲霉生長發育和次級代謝產物生成。

2.3.2 糧食受赭曲霉侵染后的營養成分分析

為測定赭曲霉侵染對糧食的損傷程度，進行赭曲霉侵染后糧食的營養成分分析。密度分別為103個/mL和106個/mL的赭曲霉孢子接種到花生、大豆、玉米和小麥上，未被侵染的種子作為對照，分析糧食營養成分的變化（圖4）。發現赭曲霉侵染種子后蛋白質、脂肪、灰分、水分、VB1、VE等指標中，VE下降最顯著（P＜0.05），103個/mL和106個/mL的赭曲霉孢子侵染后的花生、大豆、玉米和小麥VE分別下降了50%、27%、8%、25%和40%、59%、11%、46%。

圖4 不同接種量赭曲霉侵染后糧食營養成分分析Fig. 4 Nutritional analysis of grains infected with different inoculum concentrations of A. ochraceus

VE普遍存在于植物體內，是一種能阻斷自由基鏈式反應的抗氧化劑。真菌侵染宿主后，宿主產生活性氧作為防御武器[26]，誘導真菌細胞死亡，而真菌病原體產生次級代謝產物來抵抗氧化應激壓力，如黃曲霉中黃曲霉毒素[27]、禾谷鐮刀菌中的單萜烯B[28]、赭曲霉中的OTA[29]的積累，這是真菌與植物宿主互作所產生的適應性機制。推測被侵染的種子營養成分中具有抗氧化活性的VE損失最多就是赭曲霉侵染導致宿主氧化應激壓力增大，生成活性氧，導致具抗氧化活性的VE含量下降。

3 結 論

本研究探討了9S-HODE和13S-HODE對赭曲霉生長發育和OTA產生的作用。結果發現赭曲霉群體密度可以影響9S-HODE、13S-HODE及OTA合成，在低密度群體下產生的9S-HODE/13S-HODE比值高于高群體密度，產生更多的OTA。9S-HODE抑制赭曲霉菌落生長和孢子產生，促進OTA產生，而13S-HODE促進赭曲霉菌落生長和孢子產生，抑制OTA產生，表明外源添加氧脂素可以影響赭曲霉孢子產生和OTA合成。赭曲霉對油料作物如花生和大豆的侵染程度強于玉米和小麥。群體密度可以影響赭曲霉氧脂素和OTA的產生，氧脂素9S-HODE和13S-HODE可能作為赭曲霉的群體感應的信號分子，調節赭曲霉的生長發育和OTA的產量，脂肪和蛋白質含量高的糧食種子可能更易受到赭曲霉的侵染。群體感應可能是OTA合成的調控機理之一，明確氧脂素在赭曲霉生長發育和毒素產生中所起的作用，可以豐富赭曲霉的毒素合成調控機理的研究。