金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEK 原核表達、純化及溶液構象分析

田萬帆，劉 驥，趙燕英，唐俊妮*

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

由金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的腸毒素以其極端的熱、酸、蛋白酶水解抗性[1-7]和干燥穩定性使之在食品加工的酸熱處理[8]和食品保藏的過程中，仍然保持結構完整性，是導致形成食品中毒的重要毒力因子[9-10]。此外，由于具有直接結合抗原提呈細胞表面MHC II分子和T細胞表面T細胞受體，并能非特異性促進多克隆T淋巴細胞增殖能力，腸毒素也被稱為超抗原[11]。

金黃色葡萄球菌K型腸毒素（S. aureus enterotoxin K，SEK）編碼基因sek最早于2001年通過對S. aureus基因組序列比對分析而發現[12]。Jarraud等[13]研究表明，sek基因與編碼腸毒素SEG、SEI、SEL和SEM的基因形成一個操縱子位于腸毒素基因簇。流行病學調查顯示[14-15]，sek不但是臨床分離的致病性金葡菌菌株中最高頻出現基因之一，更是與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistant S. aureus，MRSA）的mecA基因具有顯著相關的腸毒素編碼基因，這暗示含有sek基因的金黃色葡萄球菌在逃避宿主免疫系統攻擊和抗生素抗性獲得上可能發揮重要功能。因此，對于sek基因表達調控或對其表達產物SEK蛋白的靶向性抑制，有望成為臨床上控制MRSA菌株的新策略。SEK蛋白歸屬于V型超抗原[16]，與其他各型超抗原的不同之處在于，V型超抗原具有一個被稱為α3-β8環的15 個氨基酸殘基形成的插入序列，該序列位于第3個α-螺旋和第8個β-折疊之間。研究表明SEK蛋白的α3-β8環與T淋巴細胞表面T細胞受體的Vβ結構域相互作用時發揮關鍵作用[17]，因而該插入序列可能成為抑制SEK超抗原活性的靶點。利用恒河猴[18]和臭鼩[19]進行的動物實驗結果表明，SEK蛋白沒有經典腸毒素SEA或SEB的顯著催吐活性，但發生催吐的時間與經典腸毒素SEA或SEB無顯著差異，說明SEK也是一種潛在的食品中毒致病因子，對其進行滅活研究是提高食品安全的重要手段之一。

盡管關于SEK催吐活性[18-19]、超抗原活性[12,17]、時序表達[20-21]、高靈敏度檢測[22]以及單抗中和治療策略[23]等方面被廣泛研究，但迄今為止，關于SEK蛋白溶液構象的報道并不多見。眾所周知，蛋白質生物學功能發揮依賴于天然蛋白形成正確的折疊態構象，因此，蛋白構象及其穩定性分析對于蛋白功能研究至關重要。鑒于SEK腸毒素引起食物中毒的普遍性和高發性，為進一步理解腸毒素SEK結構與功能關系，本研究通過優化SEK原核表達體系獲得重組蛋白，進而利用熒光發射譜、圓二色譜以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）對SEK溶液構象進行研究，旨在揭示維持SEK溶液構象穩定性的分子基礎，為探索破壞SEK結構穩定性，建立更加高效合理的食品消毒工藝奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

金黃色葡萄球菌SA005（該菌株攜帶enterotoxin K-like protein（selk）基因，其NCBI登錄號為KU574280.1）保存于本實驗室；感受態大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS、Rosetta（DE3） 天根生化科技（北京）有限公司；原核表達質粒pET-28a（＋） 美國Novagen公司。

1.1.2 試劑

聚合酶鏈式反應（polymerase chain raction，PCR）擴增試劑、核酸分子質量標準、限制性內切酶EcoRI、SalI 寶生物工程（大連）公司；蛋白Marker 天根生化科技（北京）有限公司；SDS-PAGE 5×上樣緩沖液康為世紀生物科技有限公司；牛血清白蛋白、胰蛋白胨、酵母粉 英國Oxoid公司；卡那霉素、氯霉素、異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside，IPTG） 美國Sigma公司；thrombin 北京博奧拓達科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、咪唑、三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris） 美國Amresco公司；Ni2＋-NTA-Sepharose、DEAE Sepharose Fast Flow 美國GE Healthcare公司；10 kDa超濾管 德國Millipore公司。

含SDS和巰基乙醇SDS-PAGE上樣緩沖液：10 mL含0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、5 mL 50%甘油、2 mL 10% SDS、0.5 mL β-巰基乙醇、1 mL 1%溴酚藍、0.9 mL蒸餾水；含SDS不含巰基乙醇SDS-PAGE上樣緩沖液：10 mL含0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、5 mL 50%甘油、2 mL 10% SDS、1 mL 1%溴酚藍、1.4 mL 蒸餾水；Buffer A：500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris（pH 8.0）；Buffer B：1 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液；thrombin儲液：1 000 U溶于1 mL磷酸緩沖液，儲液濃度1 U/μL；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HZQ-F160全溫振蕩培養箱 蘇州培英實驗設備有限公司；5804R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；WD800B型微波爐 格蘭仕集團有限公司；TSNENEN031445 PCR儀、DYY-6C型核酸電泳儀、Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；JY92-IIN型超聲破碎儀 寧波新芝生物技術有限公司；Chirascan plus圓二色譜儀 英國Applied Photophysics Limited公司；F-7000熒光光譜儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 ΔNspSEK蛋白原核表達載體的構建

根據上述模糊判斷的結果，通過加權平均法就可以得到最終的精確輸出量，即在特定偏移條件下，支撐油缸應采取的液壓缸壓力差。

引物以及ΔNspSEK（ΔN表示N端缺失，sp為信號肽signal peptide的縮寫）蛋白原核表達載體構建參考文獻[24]，金黃色葡萄球菌基因組DNA采用本實驗室建立的微波加熱法提取[25]，利用不含信號肽的sek基因上游引物序列：5’-CGTACGGAATTCCAAGGTGATATAGGA ATTG-3’（下劃線為EcoRI酶切位點），下游引物序列：5’-CGCTAGGTCGACTTATATCGTTTCTTTATAAG-3’（下劃線為SalI酶切位點，加粗體為插入的終止密碼子）進行PCR擴增[24]。擴增所得片段經瓊脂糖凝膠電泳檢測及PCR產物純化試劑盒純化后，與質粒載體pMD18-T進行T-A連接，分別將插入ΔNspsek基因的pMD18-T質粒與空載質粒pET-28a（＋）用EcoRI/SalI雙酶切，將上述雙酶切獲得的基因片段用T4 DNA連接酶連接，使得目的基因定向克隆至表達載體。將插入ΔNspsek基因的質粒命名為pET-28a（＋）-ΔNspsek，轉化至大腸桿菌DH5α擴增，將提取到的質粒pET-28a（＋）-ΔNspsek進行EcoRI/SalI雙酶切鑒定。同時將提取到的質粒送成都擎科生物技術有限公司測序。

1.3.2 重組質粒在大腸桿菌中表達條件優化

將經過測序驗證的重組質粒pET-28a（＋）-ΔNspsek分別轉化感受態大腸桿菌BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和Rosetta（DE3）篩選高表達宿主菌株，在相應的抗生素抗性平板上（卡那霉素抗性質量濃度30 μg/mL；氯霉素抗性質量濃度34 μg/mL）隨機挑取6 個含有重組質粒的單克隆菌落，分別過夜培養后，按1∶50的比例擴大至含相應抗生素抗性的LB培養基中，37 ℃振蕩培養3 h，然后加入適當濃度誘導劑IPTG后，繼續恒溫振蕩培養一定時間后，離心收集菌體，SDS-PAGE檢測蛋白表達。

選擇高表達菌株，分別進行誘導時間梯度（37 ℃，0.5 mmol/L IPTG分別誘導0、1、2、4、6、8、10、12、24 h），誘導IPTG濃度梯度（37 ℃，8 h，IPTG濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L），誘導溫度梯度（8 h，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導溫度分別為17、27、37 ℃），以及Zn2＋濃度梯度（0、1、5、10、15、20、25 mmol/L）進行優化，確定最佳誘導條件。

用獲得的最佳條件進行小量誘導，12 000 r/min、10 min離心收集菌體，緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗滌菌體2～3 次，重懸菌體進行超聲破碎，超聲破碎條件：功率30%，模式1，變幅桿Φ06，超聲破碎3 s，停3 s，共5 min。隨后12 000 r/min，離心10 min，收集上清液，沉淀以相同步驟再處理2 次，合并上清液為蛋白粗提液，蛋白粗提液與沉淀分別進行SDS-PAGE檢測，目的蛋白大部分存在于上清液，表明蛋白為可溶性表達；目的蛋白大部分存在于沉淀則為包涵體表達。

1.3.3 His-ΔNspSEK蛋白分離與純化

根據1.3.2節確定的最優表達菌株為出發菌種接種于5 mL LB液體培養基中，37 ℃過夜振蕩培養。次日將種子液轉接到500 mL LB中按照確定的最佳表達條件擴大培養，監測菌液吸光度A600nm至0.6～0.7時，進行IPTG誘導表達。離心收集菌體，菌體經PBS洗滌后重懸浮于20 mL Buffer A緩沖液中，冰浴超聲破碎，超聲破碎條件：功率285 W，振幅30%，模式1，變幅桿Φ06，超聲破碎3 s，停3 s，共15 min，離心收集上清液。將得到的His-ΔNspSEK蛋白粗提液上樣于事先用含Buffer A緩沖液平衡好鎳離子親合層析柱。先以Buffer A緩沖液和含50 mmol/L咪唑的Buffer A緩沖液除去大部分雜蛋白，再以含100 mmol/L咪唑的Buffer A洗脫目的蛋白，SDS-PAGE分析純度。隨后，采用凝血酶去除SEK His標簽，取純化的蛋白于截留分子質量10 kDa容量15 mL的Millipore超濾管脫鹽至PBS（pH 7.4）中，作為凝血酶的酶切底物，配制1 IU/μL的thrombin儲液。0.5、1.0、1.5 IU thrombin酶切300 μg SEK蛋白22 ℃、4 h。SDS-PAGE檢測酶切是否完全。最后，將酶切后的蛋白更換為Buffer B緩沖液，采用陰離子交換去除凝血酶，獲得純化的ΔNspSEK蛋白。

1.3.4 ΔNspSEK重組蛋白聚合態和熱穩定分析

將純化的ΔNspSEK蛋白分別加入2 種不同的SDSPAGE上樣緩沖液（一種是含SDS和不含巰基乙醇；另一種是同時含SDS和巰基乙醇）處理后進行SDS-PAGE分析，純化的ΔNspSEK蛋白置于100 ℃水浴0、3、6、10、20、40、60 min，牛血清白蛋白作對照，SDS-PAGE分析蛋白的受熱降解程度。

將純化的ΔNspSEK重組蛋白用Buffer B調節質量濃度為0.1 mg/mL，參考文獻[26]條件，在Chriascan plus型圓二色譜儀上進行蛋白溶液的測定，儀器參數設定為：掃描范圍190～260 nm，激發光和發射光狹縫1 nm，中速掃描，光譜校正開啟，25 ℃氮氣吹掃下進行。每個樣品掃描3 次取平均值。參考文獻[26]條件將純化的ΔNspSEK蛋白調節質量濃度為45 μg/mL，干式恒溫器25 ℃溫育10 min，后用F-7000熒光光譜儀進行測定，儀器參數設定：激發波長278 nm和295 nm，發射波譜掃描范圍為300～400 nm，掃描速率為1 200 nm/min，掃描激發光和發射光狹縫為5 nm，PMT電壓700 V，消除光柵，每個樣品掃描3 次取平均值。

1.4 數據分析和圖像處理

使用圓二色譜數據在線分析軟件DichroWeb對掃描的圓二色譜數據進行分析，選擇CDSSTR擬合方案，采用圓二色譜參考數據集SMP180，190～240 nm波長范圍內對掃描數據進行擬合，計算溶液中ΔNspSEK蛋白二級結構含量。將得到熒光光譜數據用FL Solutions轉化成Excel表格，然后用Origin7.5作出278 nm和295 nm波長處熒光光譜圖。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒pET-28a（＋）-ΔNspsek的基因測序鑒定結果

將重組表達質粒的插入基因ΔNspsek進行測序，得到長度為729 bp的片段，利用NCBI BLAST多序列比對發現克隆到的ΔNspsek基因序列與菌株SA005的selk基因序列（登錄號：KU574280.1）的第70～729位堿基序列100%吻合，第1～69位為信號肽序列。質粒雙酶切鑒定結果見圖1，表明SEK融合蛋白（His-ΔNspSEK）表達載體構建成功。

圖1 重組質粒pET-28a（）-ΔNspsek的雙酶切鑒定Fig. 1 Veri fication of pET-28a(+)-ΔNspsek positive clone by doublerestriction enzyme digestion

2.2 pET-28a（＋）-ΔNspsek在大腸桿菌中表達條件優化及可溶性表達驗證結果

將重組原核表達質粒pET-28a（＋）-ΔNspsek分別轉化至BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS、Rosetta（DE3）3 種不同的感受態細胞，對每個轉化子在平板上隨機挑選6 個單克隆，經過相同的條件進行小量誘導表達，結果如圖2所示。目標蛋白在3 種不同的宿主菌中均有明顯表達，且Rosetta（DE3）表達宿主菌中蛋白產量普遍較高（圖2C），該菌株整合了大腸桿菌缺乏的6 種稀有密碼子對應的tRNA，因此，選取表達量最高的Rosetta（DE3）菌株中的1號單克隆作為后續表達條件優化實驗的菌株，進一步探討融合蛋白的最佳表達條件。

由圖2D可知，當IPTG濃度梯度升高至0.6 mmol/L時，目標蛋白表達量最大，隨著IPTG濃度升高，雜蛋白也在增加，為減輕純化負擔，本研究選擇0.5 mmol/L為最佳IPTG濃度。由圖2E可知，隨著誘導時間的延長，目標蛋白表達量也在逐漸增加，但8 h后增加不明顯，因此，選擇最佳誘導時間為8 h。由圖2F可以看出，低溫誘導目標蛋白表達量較大，因此，設置最佳誘導溫度為27 ℃。由圖2G可知，低濃度Zn2＋并未顯著改善目標蛋白表達量，而當Zn2＋濃度高于10 mmol/L時，目的蛋白幾乎不表達，因此，Zn2＋濃度選擇為0 mmol/L。綜上所述，選擇IPTG濃度0.5 mmol/L、誘導時間8 h、誘導溫度27 ℃、不添加Zn2＋為最佳誘導條件。

利用上述最優表達條件對Rosetta（DE3）宿主菌1號單克隆進行小量誘導表達驗證，由圖2H可知，3 次平行實驗均獲得ΔNspSEK蛋白高產量表達。隨后，將1 mL菌液離心收集菌體，經Buffer A緩沖液重懸后超聲破碎，裂解液離心所得上清液見圖2I的泳道1，離心的沉淀見圖2I的泳道2，上清液中有清晰的蛋白表達條帶，結果表明融合蛋白為可溶性表達。

圖2 ΔNspsek基因在不同原核表達宿主菌中誘導表達及條件優化Fig. 2 Optimization of expression conditions for His-ΔNspSEK protein

2.3 最優條件下的His-ΔNspSEK表達純化及凝血酶切除6×His標簽結果

按上述最優條件擴大培養所得融合蛋白超聲破碎粗提液進行鎳親合層析純化，經過含10、50 mmol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫雜蛋白后，含His標簽的ΔNspSEK融合蛋白被100 mmol/L咪唑緩沖液洗脫效果好，見圖3A的第5泳道。進一步采用凝血酶切除6×His標簽肽，圖3B的泳道3效果較好，對于300 μg融合蛋白底物，凝血酶量為1.0 IU時，酶切4 h即可完全除去標簽肽。進一步將凝血酶切除標簽肽后的反應體系超濾去除標簽肽并更換為Buffer B，收集過DEAE離子交換樹脂的穿透液進行SDS-PAGE，結果如圖3C中的泳道2所示，結果表明除去His標簽肽的ΔNspSEK蛋白純度高，可以滿足后續光譜學測定。

圖3 His-ΔNspSEK蛋白的純化與凝血酶切除6×His標簽肽Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purified His-ΔNspSEK fusion protein after thrombin digestion

2.4 純化的ΔNspSEK聚合狀態分析和熱穩定分析

將凝血酶切除標簽后經DEAE純化的ΔNspSEK蛋白分成2 份，分別用含有SDS與β-巰基乙醇的樣品處理液（泳道1）和只含有SDS不含β-巰基乙醇的樣品處理液（泳道2）處理后，進行SDS-PAGE，結果如圖4A所示，由于SDS可以破壞蛋白質亞基間的非共價相互作用，β-巰基乙醇可破壞鏈內或鏈間二硫鍵，因此，泳道1顯示的是ΔNspSEK蛋白單體形式。泳道2中樣品由于缺乏β-巰基乙醇，不能破壞鏈間二硫鍵，部分ΔNspSEK蛋白以二聚體形式呈現。結果表明，在非還原態時，截除信號肽的SEK可能通過鏈間二硫鍵形成二聚體的形式存在。進一步將去除His標簽肽的ΔNspSEK重組蛋白100 ℃熱處理，間隔時間為0、3、6、10、20、40、60 min進行采樣，分別對樣品進行SDS-PAGE分析，如圖4B所示，100 ℃加熱到40 min時，重組蛋白ΔNspSEK依舊無明顯降解，但到加熱60 min時可以看出蛋白出現部分降解，說明ΔNspSEK蛋白具有較高的熱穩定性。

圖4 ΔNspSEK蛋白聚合狀態分析（A）和熱穩定性分析（B）Fig. 4 SDS-PAGE analysis of aggregation state (A) and heat stability (B) of ΔNspSEK

2.5 純化ΔNspSEK蛋白的圓二色譜和熒光發射譜分析

純化的重組蛋白ΔNspSEK遠紫外區的圓二色譜見圖5A，表現為192 nm波長處的強正峰和208 nm波長處的強負峰信號。采用DichroWeb在線分析軟件，計算溶液中ΔNspSEK重組蛋白二級結構含量為α-螺旋29.1%、β-折疊23.6%、β-轉角28%和無規卷曲19.4%，Difference（exp-recon）表明實驗數據與擬合數據之間的誤差在可接受范圍之內。由圖5B可知，蛋白溶液分別在278 nm和295 nm波長激發時，具有相同的344 nm波長色氨酸熒光發射峰。與處于親水環境的游離色氨酸354 nm波長熒光發射峰相比藍移了10 nm，說明雖然ΔNspSEK蛋白中色氨酸處于蛋白質分子表面，但仍未完全暴露于極性水環境中。

圖5 ΔNspSEK重組蛋白的遠紫外圓二色譜（A）與室溫熒光發射譜（B）Fig. 5 Far-UV circular dichroism spectra (A) and room temperature fl uorescence emission spectra (B) of ΔNspSEK fusion protein

3 討 論

本研究對SEK蛋白表達條件進行優化，并建立表達ΔNspSEK蛋白的方法。在純化蛋白前通過查找文獻得知ΔNspSEK理論等電點為7.7。而采用凝血酶酶切后雜蛋白的等電點為5.0～5.5[26-27]，據此，本研究嘗試使用陰離子交換方法進行蛋白質酶切純化。通過多次實驗證明當緩沖液pH值為7.0時，穿透后，凝血酶結合到了DEAE柱上，ΔNspSEK蛋白大部分保留在穿透液中，這樣的嘗試大大降低了酶切后的純化難度，此方法可供相關研究者借鑒。

眾所周知，加熱對于食品加工與安全具有重要作用，是食品殺菌的主要手段。本研究對金黃色葡萄球菌腸毒素重組蛋白ΔNspSEK的熱穩定進行研究，通過圓二色譜分析揭示ΔNspSEK蛋白溶液構象β-折疊為23.6%。劉驥等[26]研究認為新型腸毒素M的蛋白溶液構象β-折疊高達42%，王小紅[28]研究表明傳統B型腸毒素β-折疊達40.4%，經過121 ℃處理30 min后，仍具有39.9%的β-折疊含量。β-折疊對腸毒素熱穩定性維持具有關鍵作用，SEK的β-折疊含量比SEM和SEB的都低，因此，可以解釋SEK的熱穩定性不如SEM和SEB好，當100 ℃加熱到60 min時，蛋白出現部分降解。如果在食品加工中延長加熱時間可以破壞部分SEK腸毒素，但是還會有部分SEK穩定存在，需進一步探索破壞SEK的方法。

對融合蛋白ΔNspSEK的熒光發射譜進行分析，發現278 nm波長激發時呈現的是色氨酸特征性的344 nm波長熒光發射主峰。該峰位與295 nm波長單獨激發色氨酸殘基時，產生的熒光發射峰一致，根據蛋白質分子內能量轉移有效性和色氨酸熒光峰位相對于極性水環境（354 nm波長發射峰）的顯著藍移，可以推測純化的ΔNspSEK處于構象緊密的天然折疊狀態。

本研究成功構建SEK的融合蛋白ΔNspSEK可溶性原核表達系統，純化的融合蛋白ΔNspSEK在溶液中處于構象緊密的天然折疊狀態，ΔNspSEK蛋白熱穩定性好，為進一步研究SEK的結構與功能關系提供參考依據。