醬香型白酒大曲和糟醅的細菌多樣性分析

戴奕杰，李宗軍*，田志強

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.貴州省產品質量監督檢驗院，貴州 貴陽 550016）

白酒是中國的傳統酒類，是世界六大蒸餾酒之一。其中，醬香型白酒以其“醬香突出、優雅細膩、柔綿醇厚、回味悠長”的獨特風味，受到廣大消費者的青睞，馳名中外[1-2]。研究者認為，特殊的風格離不開獨特的釀造工藝和釀造方法：“四高二長、一大一小”，即高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒、生產周期長、貯存時間長、大用曲量、多輪次（發酵）取酒，每一個環節在醬香酒的釀造生產中都是不可或缺的，時間以1 a為1 個生產周期[3-6]。

白酒中最重要且研究最多的微生物類群是細菌，其主要來自于高溫制曲和堆積工序。方心芳先生認為，醬香白酒的典型-茅臺曲是一種細菌曲[7]。固態發酵的微生物變化及生化反應主要發生在高溫制制曲、堆積發酵工序。高溫制曲中，細菌占絕對優勢，有90%以上的數量，以獲得所需香味物質[3,8-9]。高溫堆積又網羅了空氣環境中的有益微生物，相當于“二次制曲”[10-12]。細菌及其代謝產物在高溫操作過程中強化了糟醅自身形成醬香的原動力，促進醬香物質的進一步生成，研究最多的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌被認為是利用糖類和氨基酸促成美拉德反應而大量產生呈香物質[13]。窖池發酵是將前者的代謝產物進行積累利用的過程，產酸細菌（乳酸菌、醋酸菌等）成為主力，產乙醇和二氧化碳的同時，也是酸類、酯類物質（乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等）形成的基礎[14]。

高溫大曲是優質醬香白酒重要的糖化劑、發酵劑和生香劑，具有原料易得、工藝簡單、功能性強的特點[2]。大曲在白酒釀造中有著舉足輕重的作用，其中棲息著大量微生物種屬，如細菌、霉菌及酵母等[15]。微生物成為決定大曲品質的核心因素。20世紀80年代后期，人們對傳統固態發酵白酒的再認識，使得大曲微生物的研究逐漸進入高潮[16]。王忠彥[17]、施安輝[18]、廖建民[19]等利用傳統可培養方法對大曲中的微生物進行探索和研究，揭示了大曲微生物優勢菌群的種屬分布，得到的微生物分為霉菌、細菌、酵母菌等，數量上以細菌菌群最多，霉菌次之，酵母菌則較少。聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術于21世紀初運用到大曲微生物的研究中，使人們可以更進一步認識曲酒中的微生物。Chen Tingtao等[20]醬香酒大曲中的細菌主要有芽孢桿菌、乳酸細菌、醋酸細菌等，它們是酒曲蛋白酶和淀粉酶的重要來源，對后續發酵和風味成型均具有重要影響[21]。

糟醅堆積發酵階段又稱為“二次制曲”[1,22]，在高溫環境下，高溫大曲的曲藥微生物能在糟醅上增殖、發酵，同時高溫堆積網羅、富集環境空氣中的微生物，生成醬香或醬香前體物質，為入窖發酵創造條件[23-24]。在堆積過程中，細菌和霉菌數量減少，而酵母快速生長，這一過程極大增加了酵母數量，使得窖池發酵正常進行。窖池發酵階段是產酒的過程，此時隨著發酵時間的延長，微生物數量下降，酵母和霉菌在發酵后期無法檢測到[25-26]。由于堆積溫度在50 ℃左右，極端釀造環境中的微生物多屬于中溫嗜熱菌[27]。其中，細菌以芽孢桿菌屬為主，包括地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、同時還有葡萄球菌屬、土壤桿菌屬等。正是由于醬香型白酒釀造過程中微生物的多樣性特點，共同推動了產品生產的順利進行，對醬香白酒品質、風味的形成具有重要作用。

Illumina HiSeq 2500測序系統采用pair-end邊合成邊測序技術，對環境微生物的分析已經趨向成熟，相關數據庫中的菌種分類也更加全面具體。本研究采用高通量測序技術（HiSeq測序）及生物信息學方法，對大曲和糟醅樣本中的細菌多樣性分析，以期更全面地解析醬香型白酒釀造過程中微生物群落結構特點和動態變化規律，以及不同工藝階段菌群組成的差異[28]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲樣本采集

本實驗樣本是跟蹤醬香型白酒生產企業實地生產過程中，選取醬香高溫制曲3 個階段的曲塊，采用5 點取樣法：以曲塊對角線的中點作為中心抽樣點，再于對角線上選擇4 個與中心樣點距離相等的點作為抽樣點，5 個樣點取相同體積的曲塊。將上述采樣位點的樣品直接破碎并混勻后，分裝于無菌袋封裝標記，于－80 ℃冰箱中保存。具體采樣信息見表1。

表1 高溫大曲樣本信息Table 1 Information about samples of high-temperature Daqu

1.1.2 糟醅樣本采集

表2 發酵釀酒糟醅樣本信息Table 2 Information about samples of fermented grains

按照傳統醬酒的釀造工藝，采用上述準備的大曲，在酒廠進行醬酒的釀造。選取整個醬香白酒發酵工藝的下沙、造沙和7 輪次發酵過程的高溫堆積、窖池發酵工序的糟醅，具體取樣時間如表2所示，采用如圖1、2中的位置對高溫堆積和窖池發酵糟醅進行取樣，每個取樣的量保持一致。將每次取樣點糟醅直接混勻后分裝于無菌袋封裝標記，于－80 ℃冰箱中保存。

圖1 高溫堆積過程取樣點位示意圖Fig. 1 Schematic diagram of sampling points during high-temperature stacking fermentation

圖2 窖池發酵糟醅取樣示意圖Fig. 2 Sampling points of fermented grains in the pit

1.1.3 試劑

DNA提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司； HiSeq Rapid SBS Kit v2測序試劑盒（FC-402-4023 500 Cycle）及文庫構建TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit（FC-121-3001/3003） 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

Qubit 2.0熒光定量儀 美國Thermo Fisher公司；NanoVue系統 美國GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

稱取7 g大曲和糟醅樣品，用20 mL滅菌后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）懸浮，加入玻璃珠，旋渦振蕩5 min。300×g離心5 min，取上清液，沉淀用PBS重復洗滌3 次，離心后收集上清液。全部上清液于10 000×g離心15 min，棄去上清液，收集細胞沉淀。再用5 mL PBS洗3 次，每次以10 000×g離心15 min，收集沉淀。最后將沉淀重新懸浮于2 mL PBS中，－20 ℃保存[29]。

1.3.2 樣品DNA提取及16S rDNA測序分析

采用環境樣本D N A提取試劑盒進行基因組D N A抽提后，使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。使用細菌的16S rDNA通用引物對樣品所提取的DNA進行擴增，16S rDNA V4可變區引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[30]。每個樣本進行3 個重復，每個PCR終止于線性擴增期，PCR結束后將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測條件5 V/cm、20 min，使用OMEGA膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-EDTA緩沖液洗脫回收目標DNA片段。將PCR回收產物用Qubit 2.0或NanoVue系統進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit進行文庫構建。使用HiSeq Rapid SBS Kit v2測序試劑盒進行測序。

1.4 高通量測序數據統計分析

對于雙端測序得到的PE reads首先使用FLASH[31]進行拼接，根據Barcode區分不同來源的樣本。對序列質量進行質控，在去除低質量堿基及接頭污染序列等操作過程后完成數據過濾，得到可供后續分析的高質量有效序列。

使用QIIME[32]等軟件在97%的相似性水平上利用UPARSE算法[33]進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）的聚類，并挑選出OTU的代表性序列。

使用Uchime[34]去除嵌合體，并采用Silva等數據庫[35]進行物種分類信息的劃分，同時去除注釋為葉綠體、線粒體以及非細菌或古菌界的OTU。

使用PyNAST算法[36]對代表性序列進行比對并過濾，然后使用FastTree[37]重構建進化樹。從OTU表中去除在進化樹重構建過程中被過濾掉的OTU，重抽樣OTU表使每個樣品具有相同的序列數。

基于上述結果在群落組成水平和系統發育水平上使用QIIME和R等軟件對樣本進行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析和群落結構的差異性分析等，在物種水平上進行物種的差異分析和相關分析等。

2 結果與分析

2.1 醬香型白酒大曲的細菌多樣性分析

2.1.1 細菌群落多樣性指數

使用UPARSE算法在97%的相似性水平上進行OTU的聚類，篩選出OTU的代表性序列，并比對數據庫進行物種分類信息的劃分。使用QIIME對樣本進行Alpha多樣性分析，包括豐富程度等級（Rank-Abundance）曲線，以及以Observed、Shannon及Chao1指數繪制的稀疏曲線。

Rank-Abundance曲線是分析多樣性的一種方式。構建方法是統計單一樣本中，每個OTU所含的序列數，將OTU按豐度（所含有的序列條數）由大到小等級排序，再以OTU等級為橫坐標，以累積序列豐度為縱坐標作圖。Rank-Abundance曲線可用來解釋多樣性的兩個方面，即物種多度和物種均勻度。在水平方向，物種的多度由曲線的寬度來反映，物種的多度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀（平滑程度）反映了樣本中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。從圖3可看出，物種分布較為均勻。

圖3 大曲16S rDNA Rank-Abundance曲線Fig. 3 Rank-Abundance curves for bacterial 16S rDNA from Daqu

圖4 大曲16S rDNA多樣性指數分析Fig. 4 16S rDNA diversity analysis of bacteria from Daqu

稀疏曲線是從樣本中隨機抽取一定數量的個體樣本，統計這些個體所代表的物種數目，以圖示反映樣本中物種的豐富程度。當曲線趨于平緩時可認為測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種。樣本曲線的延伸終點的橫坐標位置為該樣本的測序數量，如果曲線趨于平坦表明測序已趨于飽和，增加測序數據無法再找到更多的OTU；反之表明不飽和，增加數據量可以發現更多OTU。圖4結果顯示，高溫制曲階段，細菌的微生物豐富度較好，本實驗的測序量也能夠較好地反映出樣本內的微生物信息。表3豐度指數顯示，隨著發酵時間的推移，大曲的多樣性指數（Shannon：3.40）、分類OTU（Observed：360）、物種豐度指數（Chao1：581）均趨于穩定。

表3 基于16S rDNA測序高溫大曲Alpha多樣性指數Table 3 Alpha diversity indexes based on 16S rDNA sequencing of bacteria from high temperature Daqu

2.1.2 細菌群落結構分析

圖5 門分類水平上的細菌菌群Fig. 5 Bacterial community structure at phylum level

圖6 屬分類水平上的細菌菌群Fig. 6 Taxonomic analysis of bacteria at genus level

將每個OTU與數據庫進行比對，選取置信度閾值，即相似度在97%以上的序列進行物種分類，得到每個OTU的分類水平，即門、綱、目、科、屬分類水平。分析高溫制曲3 個時期樣本的細菌菌類，從圖5、6可以看出，高溫制曲階段，占據主導地位的細菌菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）4 類菌門；隨著曲藥貯存時間的延長，Firmicutes和Bacteroidetes的菌群數量逐漸下降，而Proteobacteria、Actinobacteria的數量則呈現上升趨勢。根據測序結果，在大曲中共鑒定出18 個門167 個屬的細菌微生物。其中，優勢菌屬有Clostridium sensu stricto1、Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Mycoplasma、Citrobacter等，諸如Escherichia-Shigella、Actinobacillus、Bifidobacterium、Citrobacter等細菌隨貯存時間的延長而增加，Clostridium sensu stricto1、Mycoplasma等表現為先上升后下降，而Lactobacillus、Peptoclostridium等無明顯變化，Streptococcus等細菌呈現下降趨勢。高溫制曲階段，由于高溫條件下，保留大量的嗜熱性細菌，研究者認為醬香物質是來源于曲藥，即高溫制曲產物。本實驗中梭菌屬、芽孢桿菌、乳酸菌等占主導優勢，它們能夠分泌蛋白酶、淀粉酶等水解原料，產生發酵性糖和氨基酸，為發酵釀酒過程中美拉德反應的進行提供大量原料。

2.2 醬香型白酒發酵過程中糟醅的細菌多樣性分析

2.2.1 細菌群落多樣性指數

圖7 糟醅16S rDNA多樣性指數分析Fig. 7 16S rDNA diversity analysis of bacteria from fermented grains

傳統的白酒釀造是開放式-半開放式的生產，環境空氣、車間、工具、發酵設備、參與人員等都附著著豐富的微生物群，通過不斷的生長繁殖進入到糟醅之中，因此，堆積發酵也有“二次制曲”之稱。分析“四高”中的高溫堆積和窖池發酵階段細菌微生物群落結構，從下沙環節開始到第7輪次酒起窖為止，共采集16 個糟醅樣本進行測序分析，圖7結果顯示，堆積發酵和窖池發酵階段，曲線較為平緩，說明細菌的微生物分布均勻且物種組成豐富。表4與圖8顯示，OTU個數均達270以上；隨著發酵時間的推移，發酵過程的多樣性指數（Shannon）除了第3輪次下窖樣本較低，其他樣本均在3.0以上；物種豐度指數（Chao1）基本呈現堆積發酵（下窖）樣本低，窖池發酵（起窖）樣本高的變化。

表4 基于16S rDNA測序糟醅Alpha多樣性指數Table 4 Alpha diversity indexes based on 16S rDNA sequencing of bacteria from fermented grains

圖8 糟醅16S rDNA多樣性指數分析Fig. 8 16S rDNA diversity analysis of bacteria from fermented grains

2.2.2 細菌群落結構分析

從圖9、10可看出，發酵時期，占據主導地位的細菌菌群為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes 4 類；隨著發酵時間的推移，Firmicutes前期下降，中期從第2輪次起窖開始菌類上升，后期的第6輪次起窖種類下降，其中，第3輪次下窖占比達到最高值（0.817 851 959）、第4輪次起窖最低（0.400 217 707）；Proteobacteria變化趨勢與前者相反；Actinobacteria、Bacteroidetes則無明顯變化規律。對OTU分類結果進行分析統計，發酵階段共鑒定出22 個門和221 個屬，相對豐度較高菌屬為：Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Clostridium sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter等。糟醅細菌中Escherichia-Shigella、Lactobacillus在發酵前期菌數先升高，中期從第2輪次開始下降，第3輪次下窖時達到最低，后期逐漸上升。Clostridium sensu stricto1、Streptococcus菌群豐度變化規律復雜，呈現先下降后上升的趨勢，值得一提的是Clostridium sensu stricto1菌種在第3輪次下窖時達到最高。Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter雖占比不及前三者，但變化較為穩定。

發酵釀酒過程分為高溫堆積和窖池發酵兩部分：高溫堆積階段將糧醅或蒸餾后的糟醅在晾堂攤涼、拌曲后堆成的圓堆，進行堆積發酵至頂溫；窖池發酵是加入曲的糧糟在窖池內糖化，依賴于窖池中各種微生物群落的功能和作用完成釀造過程。本實驗發酵釀酒工藝中，細菌微生物相對豐度較高，優勢細菌Escherichia-Shigella、Lactobacillus隨輪次的增加，表現為前期堆積發酵（下窖）高、窖池發酵（起窖）低，后期窖池發酵（起窖）高的變化趨勢；而Clostridium sensu stricto1、Streptococcus等表現相反變化；說明部分芽孢桿菌屬及乳桿菌屬在窖泥種代謝旺盛，為下窖提供前體物質，并影響著輪次酒的風格形成。

圖9 門分類水平上的細菌菌群Fig. 9 Bacterial community structure at phylum level

圖10 屬分類水平上的細菌菌群Fig. 10 Bacterial community structure at genus level

2.3 大曲和糟醅的細菌多樣性比較

圖11 屬分類水平細菌的豐度類群熱圖Fig. 11 Heat map of relative abundance of bacteria at genus level

特定的生產工藝導致了特定的微生物組成和動態變化，由于高溫制曲和堆積發酵時期存在的微生物群落存在差異，其中物質代謝、能量代謝的結果也有所不同，導致了醬香型白酒特征風味的差異。本節針對大曲和糟醅中的細菌群落結構進行比較分析，包括聚類分析、韋恩分析、網絡Network分析，以期了解其中優勢菌類的差異性和不同時期細菌微生物間的相互作用。

從圖11可知，無論是高溫制曲時期還是發酵時期，占據主導地位的細菌菌群為Firmicutes，其中占比較多的屬是Clostridium sensu stricto1、Lactobacillus、Streptococcus；其次是變形菌門Proteobacteria，其中占比較多的屬是Escherichia-Shigella、Actinobacillus；然后是放線菌門Actinobacteria，其中Bifidobacterium占比最多。另外，豐度較低的細菌菌類中Mycoplasma、Sarcina、Staphylococcus在大曲中的豐度高于糟醅，Citrobacter、Turicibacter、Enterobacter、Prevotella9在大曲中的豐度低于糟醅樣本。

圖12 樣本OTU韋恩圖Fig. 12 Wayne diagram for bacterial OTUs from Daqu and fermented grains

圖12 顯示，大曲和糟醅的OTU中有98.66%的序列占比形成交集，而糟醅有342 個OTU獨有，相比之下，大曲只有28 個OTU獨有。

3 結 論

通過采集大曲和糟醅不同發酵時間的樣本，提取細菌DNA并根據16S rDNA V4多變區序列的特異性引物進行PCR擴增，隨后利用Illumina HiSeq 2500測序技術對擴增產物進行高通量測序。得到的測序數據使用生物信息學方法進行微生物多樣性分析，包括OTU、Alpha多樣性分析、群落組成分析等。結果顯示：醬香型白酒的高溫制曲、堆積發酵和窖池發酵的微生物菌群在數量及結構分布上具有多樣性，菌群種類基本一致。兩個階段的優勢菌門均為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes 4 類。隨著發酵時間的推移，各輪次酒糟醅中微生物群落呈現一定的變化規律，大曲樣本的細菌菌類變化與貯存時間有關，而糟醅微生物隨窖內發酵及高溫堆積的工藝而不斷變化。隨著溫度和水分達到相對平衡，細菌群落也逐漸得到了調整，形成單一菌類為主導的環境，更有利于醬香型白酒的釀造。

制曲和制酒階段的生態環境之間存在差異，導致微生物優勢菌不同：大曲相對豐度較高的菌屬為Clostridium sensu stricto 1、Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Mycoplasma、Citrobacter等。糟醅的優勢菌屬為Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Clostridium sensu stricto 1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter。韋恩分析顯示，2 個階段的微生物菌落既有交集也有各自特有的菌類，結合熱圖比較發現，存在一些細菌菌類豐度上的差異，如Mycoplasma、Sarcina、Staphylococcus在大曲中的豐度高于糟醅，檸檬酸桿菌屬Citrobacter、Turicibacter、Enterobacter、Prevotella 9低于糟醅樣本。