納豆菌液態發酵蕎麥產納豆激酶及其代謝特性分析

趙謀明，鄒 穎，林戀竹,*，吳 見

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；2.紐斯葆廣賽（廣東）生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510931）

納豆激酶是一種在納豆發酵過程中由納豆菌產生的絲氨酸蛋白酶[1-3]，具有高效溶血栓活性，極具開發價值[4-5]。近年來利用納豆菌液態發酵法生產納豆激酶已經成為趨勢。選擇特色的發酵底物，并對發酵培養基及發酵條件進行優化以實現發酵底物的高效利用，是降低納豆激酶生產成本的重要途徑。蕎麥含有豐富的碳水化合物、蛋白質、維生素、膳食纖維、礦物元素等營養成分[6]。黃酮類化合物如蘆丁，是蕎麥最重要的生物活性物質之一，具有很強的抗氧化活性，對心血管疾病以及高血糖、高血脂等慢性疾病具有較好的防治作用[7-8]。前期研究結果表明，在基礎培養基中添加蕎麥可以促進納豆菌產納豆激酶并提高發酵產物的抗氧化活性[9]。

肽類物質是優良的氮源，具有促進微生物生長發育和加速新陳代謝的作用[10]。枯草芽孢桿菌液態發酵培養基多使用蛋白胨作為氮源。蛋白胨成本較高，且市場上綠色安全的食品級蛋白胨較少。以大豆蛋白為原料，采用食品級蛋白酶法制備大豆蛋白酶解物具有綠色、安全的特點[11]，可以取代國內發酵工業中所用的價格高昂蛋白胨類產品，達到降低成本提高食用安全性目的。

本實驗擬優化納豆菌液態發酵蕎麥產納豆激酶揺瓶、發酵罐條件，制備高納豆激酶活力、富含谷物多酚且具有強抗氧化活性的發酵產物。對比大豆分離蛋白酶解物與商業大豆蛋白胨作為補充氮源時菌體生長規律以及代謝物質（酶、可溶性蛋白、還原糖、多酚及抗氧化物質）變化規律，為工業化放大生產納豆激酶提供理論與方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆菌（Bacillus subtilis natto） 中國農業大學食品科學與營養工程學院；蕎麥 南沙舊鎮天匯百貨超市；大豆分離蛋白 廣州合誠實業有限公司；凝血酶、纖維蛋白原 上海源葉生物科技有限公司；BCA試劑盒 廣州鼎國生物科技有限公司；2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis (2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）、熒光素、Trolox（純度99%）美國Sigma公司；大豆蛋白胨 廣東環凱微生物科技有限公司；胰酶、NS37071、復合蛋白酶、α-淀粉酶（10 000 U/g） 諾維信公司；福林-酚試劑根據GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》規定方法配制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Varioskan Flash型酶標儀 美國Thermo公司；UV-721型紫外分光光度計 上海精密科學儀器儀表有限公司；LRH-250A-II生化培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司；SKY-211B恒溫培養振蕩器 江蘇蘇昆儀器有限公司；BioStat B2.5 L發酵罐 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 揺瓶條件優化

種子液的制備：取試管斜面上保藏的納豆菌接種于種子培養基中（胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，100 mL/250 mL錐形瓶），37 ℃、180 r/min振蕩培養20 h。

蕎麥浸泡6 h后，按料液比1∶10（g/mL）加水打漿，分別加入不同添加量（0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%）的α-淀粉酶，90 ℃加熱40 min，得到蕎麥糖化液，調節混懸液pH 7.0，將種子液以2%的接種量接種于發酵培養基中（25 mL/250 mL錐形瓶），37 ℃、180 r/min振蕩培養24 h，考察α-淀粉酶添加量對納豆菌產納豆激酶的影響。

大豆分離蛋白酶解物的制備：取大豆分離蛋白，按料液比1∶15（g/mL）加入去離子水，攪拌至大豆分離蛋白充分水化，分別加入1%胰酶（以大豆分離蛋白質量計）、NS37071、復合蛋白酶，分別于55 ℃酶解4、8、12 h，沸水浴滅酶10 min，離心（4 ℃，8 000 r/min，15 min），取上清液，減壓濃縮后冷凍干燥，得到大豆分離蛋白酶解物。

在經過優化后的蕎麥糖化液中，分別補充不同大豆分離蛋白酶解物及商業大豆蛋白胨（添加量0.4%），調節混懸液pH 7.0，按上述搖瓶條件進行發酵，考察氮源對納豆菌產納豆激酶的影響。

在經過優化后的蕎麥糖化液中，補充經過上述優化得到的大豆分離蛋白酶解物，調節混懸液pH 7.0，按上述搖瓶條件進行發酵，考察發酵時間對納豆菌產納豆激酶的影響。

1.3.2 2.5 L發酵罐發酵條件的優化

將種子液以2%接種量接種于發酵培養基中（經1.3.1節優化得到的發酵培養基，25 mL/250 mL錐形瓶），37 ℃、180 r/min培養24 h。將搖瓶預培養后的菌體接種到裝有發酵培養基的發酵罐中，固定發酵溫度37 ℃、發酵時間36 h，分別考察通氣量（2.0、3.0、3.5 L/min）、攪拌速率（200、300、400 r/min）、裝液量（1、1.2、1.5 L）、接種量（2.0%、3.0%、4.0%）對納豆菌產納豆激酶的影響。

1.3.3 2.5 L發酵罐中菌體生長和代謝特性分析

分別于蕎麥糖化液中補充大豆分離蛋白酶解物和商業大豆蛋白胨，在發酵罐優化條件下，使用pH電極和復膜氧電極在線監測發酵過程中pH值與溶氧的變化。發酵過程中，每間隔6 h取樣，分別測定生物量、納豆激酶活力、可溶性蛋白、還原糖、總酚含量、氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）。

1.3.4 指標的測定

1.3.4.1 納豆激酶活力

纖維蛋白平板法：參照Astrup等[12]的方法并加以改進。將13.35 mg纖維蛋白原溶于15 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中，制成0.89 mg/mL的纖維蛋白原緩沖溶液，50 ℃保溫5～10 min。將7.5 U凝血酶溶于1 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中制得凝血酶緩沖溶液。配制1%瓊脂糖溶液，50 ℃保溫10 min，將1 mL 7.5 U/mL凝血酶緩沖溶液、15 mL纖維蛋白原溶液以及20 mL瓊脂糖溶液迅速混勻，立即倒平板，凝固后進行打孔，取10 μL發酵產物加樣于纖維蛋白原平板孔中，37 ℃孵育18 h，用游標卡尺測量透明圈直徑，并計算透明圈面積。一個酶活力單位（U）定義為1 min內水解纖維蛋白產生0.01 mm2透明圈所需要的酶量。

紫外分光光度計法[13]：將1.4 mL的Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.8）和0.4 mL 0.72 g/100 mL的纖維蛋白原溶液混合，振蕩后于37 ℃放置10 min；加入0.1 mL凝血酶溶液（20 U/L）充分混勻，37 ℃放置10 min，于上述溶液中加入0.1 mL樣品溶液（對照組不加），37 ℃水浴保溫反應1 h。每隔20 min振蕩一次，最后加入2 mL 0.2 mol/L的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）終止反應（對照組同時添加樣品溶液），37 ℃水浴中放置20 min，將上述反應于10 000 r/min離心10 min，測定275 nm波長處的吸光度。一個酶活力單位（FU）定義為1 min內在275 nm波長處吸光度變化0.01所需要的酶量。

1.3.4.2 生物量

采用萬春艷[11]的方法（細胞干重法），準確量取25 mL發酵液，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌2 次后，將菌體轉移到干燥皿中，105 ℃烘干至恒質量。

1.3.4.3 可溶性蛋白

按BCA試劑盒方法，以牛血清蛋白為標準品測定蛋白質量濃度。

1.3.4.4 還原糖

還原糖的測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[14]。

1.3.4.5 總酚

采用Lin Lianzhu等[15]的方法，取樣0.5 mL，加蒸餾水至6 mL，搖勻，加入0.5 mL福林-酚試劑搖勻，在1～8 min內加入20% Na2CO3溶液1.5 mL，加入蒸餾水至10 mL搖勻，40 ℃保溫2 h，迅速冷卻后，立即在760 nm波長處測定其吸光度。以沒食子酸為標準品做標準曲線，計算總酚含量。

1.3.4.6 ORAC

參考林戀竹等[16]的方法，在微孔板中分別加入25 μL樣品溶液或Trolox溶液或緩沖液（75 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液，pH 7.4），然后加入75 μL 0.159 μmol/L熒光素鈉溶液，37 ℃孵育10 min后，加入100 μL 38.25 mmol/L AAPH，保持反應體系溫度恒定為37 ℃，設定激發波長為485 nm，發射波長為530 nm，開始計時反應并讀數（f0），每分鐘讀一次數（f1、f2、…、f70）共讀71 次數（共計反應70 min），將每次讀數連成曲線。計算見公式（1）、（2）：

式中：AUC為曲線下的面積；NetAUC為樣品曲線下面積與空白曲線下面積之差。

Trolox濃度與NetAUC呈線性關系，換算得到樣品的ORAC值，即達到每千克樣品的ORAC所需Trolox的量（mmol/kg）。ORAC值越高，則樣品抗氧化活性越強，抗氧化活性以Trolox當量表示。

1.3.4.7 菌體比生長速率與代謝物質比合成速率

菌體比生長速率（μm）是指菌體生長速率與菌體濃度之比，代謝物質比合成速率（μp）是指代謝物質合成速率與代謝物質濃度之比，其計算分別見式（3）、（4）：

式中：x為不同發酵時間時菌體質量濃度/（g/L）；y為不同發酵時間代謝物質質量濃度/（g/L）。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 納豆菌液態發酵蕎麥產納豆激酶搖瓶條件優化結果

2.1.1α-淀粉酶添加量對納豆菌液態發酵蕎麥產納豆激酶活力的影響

圖1 α-淀粉酶添加量對納豆菌液態發酵產納豆激酶活力的影響Fig. 1 Effect of α-amylase addition on the production of nattokinase

如圖1所示，隨著α-淀粉酶添加量的增加，納豆激酶活力呈現先升高后下降的趨勢。未添加α-淀粉酶的發酵培養基黏稠且流動性差，不利于納豆菌利用；添加α-淀粉酶后，蕎麥中淀粉被可控水解，更容易被納豆菌利用，納豆激酶活力從未添加α-淀粉酶時的420.12 U/mL提升到535.66 U/mL，故選擇α-淀粉酶添加量為0.4%。碳源供給菌體生命活動所需營養，對菌體產酶具有誘導或阻遏作用[17]。將麥芽糖或葡萄糖作為碳源時，納豆菌所產納豆激酶活力較高，以可溶性淀粉作為碳源時，納豆菌所產納豆激酶活力相對較低[18]。葡萄糖是易被吸收利用的碳源，屬于速效碳源，然而速效碳源在高濃度時可能會表現出阻遏作用；被菌體緩慢利用的碳源往往更有利于產物生成，尤其是次生代謝產物的合成，這是由于碳源的適中利用速率恰好滿足產物合成的需求[19]。因此，通過優化碳源組成調控菌體產酶，是提高發酵產物中納豆激酶活力的重要途徑。α-淀粉酶可以快速將直鏈淀粉水解成麥芽糖和麥芽三糖，再將麥芽三糖水解成葡萄糖和麥芽糖[20]。通過對蕎麥淀粉進行適度水解優化培養基中碳源組成，可提高納豆激酶活力。

2.1.2 補充氮源對納豆菌液態發酵蕎麥產納豆激酶活力的影響

納豆菌對氮源的選擇性較高，僅在以大豆蛋白胨為氮源時有較高的蛋白酶活力和納豆激酶活力，使用其他有機氮源時，菌體能生長，但酶活力相對較低[19]。大豆蛋白胨是大豆蛋白經過酸、堿或酶水解而成的一種由肽類物質、氨基酸組成的混合物，可大大加快酶的合成速率[21]。

表1 添加氮源對納豆菌液態發酵產納豆激酶活力的影響Table 1 Effect of nitrogen sources on the production of nattokinase

如表1所示，大豆分離蛋白酶解物的水解度隨酶解時間延長而增加。3 種酶水解大豆分離蛋白所得酶解物水解度從高到低依次為胰酶＞NS37071＞復合蛋白酶。不同水解度的大豆分離蛋白酶解物作為補充氮源時，納豆激酶活力存在顯著性差異。然而，大豆蛋白酶解物的促產酶活力不隨其水解度的增加而增加。補充NS37071酶解產物，所得發酵產物中納豆激酶活力較補充胰酶/復合蛋白酶酶解產物高。不同蛋白酶促產酶活力不同，這可能是由于各種蛋白酶的酶切位點不同，導致酶解產物組成不同[22]。補充NS37071酶解12 h時所制得的酶解物，發酵產物中納豆激酶活力可達595.64 U/mL，與添加商業大豆蛋白胨發酵所產納豆激酶活力無顯著性差異。

2.1.3 發酵時間對納豆菌液態發酵產納豆激酶活力的影響

在發酵過程中，在產酶總量達到峰值時應及時停止發酵，否則酶活力就可能會出現回落的現象[9]。如圖2所示，在發酵前期，納豆激酶活力隨發酵時間的延長不斷增加，至36 h，達到最高值；在發酵后期隨發酵時間的延長，納豆激酶活力逐漸降低。故選定36 h為最佳發酵時間。

圖2 發酵時間對納豆菌液態發酵產納豆激酶活力的影響Fig. 2 Effect of fermentation time on the production of nattokinase

納豆菌液態發酵蕎麥產納豆激酶的揺瓶條件為蕎麥浸泡6 h后，按料液比1∶10（g/mL）加水打漿，加入0.4%α-淀粉酶，90 ℃加熱40 min，補充NS37071酶解12 h時所制得酶解物為氮源，調節發酵培養基pH 7.0，裝液量10%，接種量3%，搖床轉速180 r/min，發酵溫度37 ℃，發酵時間36 h，酶活力從420.12 U/mL提升至756.96 U/mL。

2.2 2.5 L發酵罐發酵條件的優化結果

圖3 通氣量（A）、轉速（B）、裝液量（C）、接種量（D）對納豆菌液態發酵產納豆激酶的影響Fig. 3 Effects of ventilation (A), stirring speed (B), loading volume (C)and inoculum size (D) on the production of nattokinase

納豆菌發酵屬于極其好氧發酵，通氣量直接影響發酵罐中的溶氧。如圖3A所示，當通氣量為2.0 L/min時，納豆激酶活力較低，隨著通氣量的增加，納豆激酶活力增加。因通氣量較大時容易起泡，選擇通氣量為3.5 L/min。攪拌速率直接影響培養基的溶氧，在通氣量不變的條件下，提高攪拌速率可以提高傳氧速率，但轉速過高，產生的剪切力可能損害微生物菌體，使菌體生長變緩，也可能影響產物活性[23]，選擇轉速300 r/min（圖3B）。裝液量增加至1.5 L時，納豆激酶活力降低，因此選擇裝液量為1.2 L（圖3C）。接種量對于發酵尤其是大規模發酵有重要影響，合適的接種量可以使微生物迅速增殖，減少雜菌污染機會，提高發酵效率；過大的接種量會導致細胞生長過快，造成有害物質的大量積累和培養液黏度的改變，反而影響產物的合成[24]。隨接種量增加，納豆激酶活力呈先升高后降低的趨勢，因此選擇3%接種量（圖3D）。最終得到優化后的發酵罐最佳條件為通氣量3.5 L/min、轉速300 r/min、裝液量1.2 L、接種量3%、發酵36 h，酶活力達到834.91 U/mL，相當于152.5 FU/mL（為方便與文獻所報道的納豆激酶酶活力水平進行對比，采用紫外分光光度計法測定納豆激酶活力），與文獻[25-28]報道未經過基因重組的納豆菌液態發酵所產納豆激酶活力（≤130.96 FU/mL）相比有一定的優勢。

2.3 2.5 L發酵罐中菌體生長和代謝特性分析

自制大豆蛋白酶解物與商業大豆蛋白胨作為補充氮源時，在搖瓶條件下，納豆菌所產納豆激酶活力并無顯著性差異。然而，兩者的水解度、氨基酸組成與分子質量分布不同。在菌體放大培養時，兩者可能會對菌體的生長和代謝有不同的影響。本實驗通過對比研究補充自制大豆蛋白酶解物與商業大豆蛋白胨時，2.5 L發酵罐中菌體生長和代謝特性，揭示自制大豆蛋白酶解產物作為補充氮源的優勢。

2.3.1 氮源對納豆菌發酵過程生物量和比生長速率的影響

如圖4A所示，添加自制大豆蛋白酶解物與商業大豆蛋白胨組均幾乎沒有延滯期，立即進入生長對數期，隨發酵時間延長，生物量快速增加。商業大豆蛋白胨組發酵18 h后緩慢生長趨于穩定，在24 h時達到最大生物量（5.81 g/L）。而大豆分離蛋白酶解物組發酵前期生長速率較慢，但對數期較長，在30 h左右生物量趨于穩定達到最大值（6.68 g/L）。

如圖4B所示，2 個組別的比生長速率均呈現先增加后降低的趨勢，商業大豆蛋白胨組在2.8 h時比生長速率最快（0.92 h－1），而大豆分離蛋白酶解物組在10.8 h時比生長速率最大（0.22 h－1）。總體而言，商業大豆蛋白胨作為補充氮源時，發酵前期菌體比生長速率更快，達到最大比生長速率時間提前，但后期動力不足。可能是因為水解度更高的商業大豆蛋白胨中小分子肽和氨基酸在發酵前期為納豆菌提供速效氮源，促進菌體生長，但后期培養基組成發生變化不利于納豆菌生長。

2.3.2 氮源對納豆菌發酵過程可溶性蛋白含量的影響

圖5 發酵過程中可溶性蛋白（A）及其比合成速率（B）的變化Fig. 5 Changes in soluble protein level (A) and its specific formation rate (B) during fermentation

如圖5A所示，添加自制大豆蛋白酶解物與商業大豆蛋白胨組在發酵過程中可溶性蛋白含量變化趨勢大致相同，均呈現先降低后略微增長的趨勢；隨著發酵過程中微生物對氮源的利用，體系內可溶性蛋白含量逐漸減少，發酵后期可溶性蛋白有所增加，可能與發酵過程中酶蛋白的分泌與積累有關；如圖5B所示，可溶性蛋白的消耗速率先增加后減小，其中商業大豆蛋白胨組在發酵9.7 h時對可溶性蛋白的消耗速率最快（0.036 h－1），大豆分離蛋白酶解物組在發酵13.6 h時對可溶性蛋白的消耗速率最快（0.037 h－1）。

2.3.3 氮源對納豆菌發酵過程還原糖含量的影響

圖6 發酵過程中還原糖（A）及其比合成速率（B）的變化Fig. 6 Changes in reducing sugar level (A) and its specific formation rate (B) during fermentation

如圖6A所示，發酵液中糖類物質逐漸被菌體利用，兩組還原糖含量均逐漸下降。大豆分離蛋白酶解物組在36 h還原糖含量趨于穩定，即不再消耗碳源；而對于商業大豆蛋白胨組，24 h后還原糖含量趨于平穩，說明納豆菌對碳源的消耗基本停止。從圖6B可知，大豆分離蛋白酶解物組在20.85 h還原糖比消耗速率最快（0.053 h－1），而商業大豆蛋白胨組在12 h后還原糖比消耗速率遠低于大豆分離蛋白酶解物組。商業大豆蛋白胨組對碳源的利用相對較少，且消耗速率較慢，使得發酵液中碳氮比發生較大變化，不利于后續發酵產酶。

2.3.4 氮源對納豆菌發酵過程pH值與溶氧的影響

圖7 大豆分離蛋白酶解物組（A）和商業大豆蛋白胨組（B）在發酵過程中pH值與溶氧的變化Fig. 7 Changes in pH and dissolved oxygen during fermentation with soy protein isolate hydrolysate (A), and commercial soybean peptone (B)as supplementary nitrogen source

如圖7所示，添加自制大豆蛋白酶解物與商業大豆蛋白胨組pH值變化趨勢整體上是一致的，初始pH 6.8左右，6 h左右降到最低值隨后上升，表明在前6 h，糖類被大量利用，分解成小分子酸、醇，使pH值迅速下降。隨著糖類的缺乏，開始大量利用氮源，氨基酸被利用后產生氨氣使pH值回升。溶氧量發酵初期急劇下降，因為高濃度發酵下菌體氧需求量大。特別是添加商業大豆蛋白胨組，溶氧下降速率更快，這是由于納豆菌快速生長需氧量急劇上升，與其比生長速率曲線相對應（圖4B）。

2.3.5 氮源對納豆菌發酵過程納豆激酶活力的影響

圖8 發酵過程中發酵過程中納豆激酶活力（A）與產物比合成速率（B）的變化Fig. 8 Changes in nattokinase activity (A) and its specific nattokinase formation rate (B) during fermentation

如圖8A所示，商業大豆蛋白胨作為補充氮源時，24 h達到酶活力最高值（604.61 U/mL），之后酶活力急劇下降；而大豆分離蛋白酶解物組酶活力持續上升至36 h達到最大值（834.91 U/mL）才出現回落。從圖8B可知，商業大豆蛋白胨組產物比合成速率呈負增長，而大豆分離蛋白酶解物組納豆激酶比合成速率曲線呈鐘形曲線，在6 h左右達最大值0.41 h－1。自制大豆蛋白酶解物與商業大豆蛋白胨水解度、氨基酸組成與分子質量分布不同，進而影響納豆激酶的合成速率。

2.3.6 氮源對納豆菌發酵過程酚類物質及抗氧化物質含量的影響

如圖9A所示，隨發酵時間延長，自制大豆蛋白酶解物與商業大豆蛋白胨組的總酚含量均逐漸增加，從初始的0.033 mg/mL分別增加到0.109 mg/mL（大豆分離蛋白酶解物組）和0.090 mg/mL（商業大豆蛋白胨組），說明酚類物質在發酵過程中隨著菌體對蕎麥的利用逐漸溶出，而大豆分離蛋白酶解物組的總酚含量要高于商業大豆蛋白胨組，說明微生物對兩組中蕎麥的利用程度不同，后者酚類物質溶出更多。如圖9B所示，兩組均呈現酚類物質比生成速率呈先增加后減小的趨勢，在12 h左右達到最大速率。

谷物多酚、肽類物質與微生物代謝產物是發酵產物發揮抗氧化活性重要的物質基礎[9]。如圖10A所示，隨著發酵時間的延長，兩組抗氧化物質含量均增加，發酵36 h時，大豆分離蛋白酶解物組的抗氧化活性（27.43 μmol/mL）高于商業大豆蛋白胨組（22.71 μmol/mL），與發酵初期（16.69 μmol/mL）相比，抗氧化活性顯著提高。如圖10B所示，抗氧化物質比生成速率均在6 h左右達到最大值，但大豆分離蛋白酶解物組抗氧化物質比生成速率最大值（0.018 1 h－1）高于商業大豆蛋白胨組（0.014 8 h－1）。

圖9 發酵過程中酚類物質（A）及其比溶出速率（B）的變化Fig. 9 Changes in phenolics level (A) and its specific dissolution rate (B)during fermentation

圖10 發酵過程中抗氧化物質（A）及其比生成速率（B）的變化Fig. 10 Changes in antioxidant activity (A) and its specific antioxidants formation rate (B) during fermentation

綜上所述，補充大豆分離蛋白酶解物時，納豆菌生長對數期較長，在30 h左右生物量趨于穩定，達到最大值（6.68 g/L）；納豆菌對可溶性蛋白與還原糖的消耗量較大，在36 h趨于平穩；納豆激酶活力持續上升至36 h達到最大值，為834.91 U/mL（152.5 FU/mL），遠高于補充商業大豆蛋白胨組（酶活力提高38%）；酚類物質比溶出速率在12 h達到最大值，抗氧化物質比生成速率在6 h達到最大值，發酵36 h時，發酵產物中酚類物質、抗氧化物質含量分別達到0.109 mg/mL及27.43 μmol/mL，遠高于補充商業大豆蛋白胨組。

3 結 論

納豆菌液態發酵蕎麥產納豆激酶2.5 L發酵罐最優條件為蕎麥浸泡6 h后，按料液比1∶10（g/mL）加水打漿，加入0.4% α-淀粉酶，90 ℃加熱40 min，補充NS37071酶解12 h時所得酶解物，調節發酵培養基pH 7.0，接種量3%，通氣量3.5 L/min，轉速300 r/min，裝液量1.2 L，發酵36 h。

以蕎麥為原料，通過常溫浸泡、加水打漿、聯合耐高溫α-淀粉酶的前處理方法，獲得以蕎麥為底物的發酵培養基。采用酶法制備大豆蛋白酶解產物，作為補充氮源添加至發酵培養基，通過優化納豆菌液態發酵條件，可制備具有高納豆激酶活力（152.5 FU/mL，與商業大豆蛋白胨組相比酶活力提高38%）、富含谷物多酚（0.109 mg/mL）且具有強抗氧化活性（27.43 μmol/mL）的發酵產物。