棒狀乳桿菌發酵秘魯魷魚糜凝膠特性的變化及其形成機理

陳曉倩，吳祖芳*，翁佩芳

（寧波大學海洋學院，應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211）

美洲大赤魷（Dosidicus gigas）俗稱秘魯魷魚，為大洋性淺海種，屬于莖柔魚屬，最大胴長1.5 m，最大體質量40 kg；其分布廣泛，在秘魯和智利沿岸及外海資源豐富，資源量在700～1 000萬 t，是最具開發潛力的海產品之一[1]。秘魯魷魚水分和粗蛋白質量分數分別為79.3%和17.2%，粗脂肪1.5%和灰分1.0%，是一種高蛋白、低脂肪的海產品[2]，然而其肉質粗糙，有酸、苦、澀味，不宜煮食[3]，目前主要作為經濟魚類的優良釣餌或者魚粉。為提高其經濟價值，有人對它進行烤制加工[4]或魷魚絲加工[5]研究，也有人利用魷魚皮制備膠原蛋白肽[6]。

魚糜制品作為一種具有良好凝膠彈性口感和獨特風味的優質蛋白產品，深受國內外廣大消費者喜歡。魚糜凝膠形成的主要成分為肌原纖維蛋白，由50%～55%的肌球蛋白、20%肌動蛋白、肌動球蛋白以及少量原肌球蛋白和肌漿蛋白組成[7]。秘魯魷魚肌肉組織中富含肌原纖維蛋白，因此，為提高秘魯魷魚經濟價值，可將其絞成魚糜進行加工。

迄今為止，利用乳酸菌發酵加工魷魚的研究僅有少量報道[8-9]，利用乳酸菌發酵其他低值水產品形成魚糜凝膠則有相關研究報道[10-17]，而利用乳酸菌發酵魷魚糜形成凝膠的研究則鮮見報道。王乃富等[10]對乳酸菌發酵鳙魚肉糜菌相與品質影響的研究發現，乳酸菌可增強鳙魚肉糜的凝膠強度和白度并促進鳙魚肉糜蛋白質的降解。陳正榮等[11]研究干酪乳桿菌發酵工藝條件對魚糜品質影響，結果表明成熟后的發酵魚糜，感官可接受性高。因此，利用乳酸菌對秘魯魷魚進行發酵加工形成魚糜凝膠具有可行性及廣闊的發展前景。

本課題組從浙東腌制菜中分離到1 株棒狀乳桿菌（編號Lz153）[18]，該菌可抑制常見食品污染微生物、降解亞硝酸鹽、不產生H2O2和H2S，且能產生獨特的風味物質，可以作為發酵食品安全生產菌株。本研究通過測定棒狀乳桿菌Lz153發酵秘魯魷魚糜凝膠強度、硬度、彈性、咀嚼性和膠黏性等凝膠特性指標和發酵過程中化學作用力變化規律，以及觀察肌原纖維蛋白在發酵過程中的變化情況，旨在揭示發酵秘魯魷魚糜凝膠形成的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秘魯魷魚 寧波飛潤海洋生物科技有限公司；食鹽、白砂糖、玉米淀粉等輔料 寧波加貝超市；菌株：棒狀乳桿菌Lz153（Lactobacillus coryniformis Lz153） 寧波大學食品生物技術實驗室保藏。

MRS肉湯、MRS培養基 杭州微生物試劑有限公司；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DNTB） 上海晶純生化科技股份有限公司；β-巰基乙醇、考馬斯亮藍、牛血清蛋白標準品索萊寶生物技術有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、尿素、乙二胺四乙酸（edetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、冰醋酸、乙醇、甲醇 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-40B I型立式蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；QYC-2102C全溫振蕩培養箱 寧波江南儀器廠；XHF-D內切式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司；TA.XT Plus質構儀 英國SMS公司；高速冷凍離心機德國Eppendorf公司；紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；DYCZ-25D型電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵劑制備

在MRS肉湯中活化棒狀乳桿菌Lz153，37 ℃搖床培養24 h后，按1%接種量重復活化3 次，8 000×g離心10 min（4 ℃）后收集菌體，用生理鹽水重懸至菌液濃度約為107CFU/mL。

1.3.2 秘魯魷魚糜、乳酸菌發酵魷魚糜凝膠制備

冷凍秘魯魷魚足去皮及結締組織，取肌肉組織，自來水漂洗[19]3 次，瀝水攪打成糜冷凍備用。冷凍魚糜解凍，加入輔料鹽1.5%、糖5%、玉米淀粉1%，并按1%的量接種發酵劑，真空包裝，30 ℃發酵培養，發酵時間分別為24、30、36、42 h和48 h。

1.3.3 肌原纖維蛋白提取

取不同發酵時間的魚糜凝膠（發酵0 h為對照組）1 g，加入5 mL含有50 mmol/L NaCl的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，冰水浴中勻漿，4 ℃、5 000×g離心15 min，棄上清液，按上述步驟重復操作2 次。收集沉淀加入10 mL 0.6 mol/L NaCl溶液，冰水浴中勻漿，4 ℃、10 000×g離心10 min，上清液用紗布過濾去除結締組織后加入3 倍體積的冷蒸餾水稀釋蛋白溶液使肌原纖維蛋白沉淀，4 ℃、10 000×g離心20 min收集肌原纖維蛋白沉淀。用0.6 mol/L NaCl溶液溶解后將肌原纖維蛋白貯存于4 ℃，需在18 h內使用。

1.3.4 pH值的測定

取不同發酵時間的魚糜凝膠（發酵0 h為對照組）2 g，加18 mL去離子水，均質后用PHS-3C pH計0～48 h內每隔6 h測定其pH值。

1.3.5 凝膠特性的測定

1.3.5.1 凝膠強度

將不同發酵時間的魚糜凝膠切成約25 mm置于TA.XT Plus質構儀試驗臺上，壓縮力模式，探頭P0.5S，測中速率1 mm/s，形變量50%。探頭對其下壓刺穿，穿刺曲線上的第1個峰為破斷強度。凝膠強度按式（1）計算：

1.3.5.2 全質構模式

測定不同發酵時間段魚糜凝膠樣品彈性、硬度、咀嚼性和膠黏性，探頭為P36，測中速率2 mm/s，形變量50%。

1.3.6 化學作用力的測定

1.3.6.1 離子鍵、氫鍵及疏水相互作用

參考Gomez-Guillen等[20]方法，取1.3.2節不同發酵時間的魚糜凝膠（發酵0 h為對照組）2 g，分別加入10 mL不同處理液：0.05 mol/L NaCl（SA）溶液、0.6 mol/L NaCl（SB）溶液、0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L 尿素（SC）溶液和0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素（SD）溶液，均質后4 ℃靜置1 h，10 000×g離心15 min。離子鍵含量以溶解于SB溶液與SA溶液中蛋白質含量差表示；氫鍵含量以溶解于SC溶液與SB溶液中蛋白質含量差表示；疏水相互作用含量以溶解于SD溶液與SC溶液中蛋白質含量差表示。上清液中蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法。

1.3.6.2 二硫鍵

總巰基含量測定：取不同發酵時間的魚糜凝膠（發酵0 h為對照組）1 g，設3 組平行，分別加入30 mL處理液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0），勻漿機均質后室溫連續攪拌6 h，12 000×g離心20 min去除沉淀。各取3 mL上清液，加入0.3 mL 0.1%的DTNB溶液[22-23]，40 ℃水浴25 min，分光光度計412 nm波長處測定上清液的吸光度，以摩爾消光系數13 600 L/（mol·cm）計算。總蛋白含量為樣品直接溶解于0.5 mol/L NaOH溶液中蛋白質量，蛋白含量用考馬斯亮藍法測定。

二硫鍵含量測定：取不同發酵時間的魚糜凝膠（發酵0 h為對照組）1 g，設3 組平行，分別加入30 mL處理液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，0.15 mol/L β-巰基乙醇，pH 8.0），勻漿機均質后室溫連續攪拌6 h，添加50 g/100 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液至最終質量分數為5%，繼續攪拌2 h后5 000×g離心收集沉淀。沉淀部分用5 g/100 mL的TCA溶液漂洗2 次去除殘留的β-巰基乙醇，再溶解于20 mL不含β-巰基乙醇的處理液，12 000×g離心20 min收集上清液。上清液中巰基含量的測定方法同總巰基含量，巰基含量和二硫鍵含量分別按式（2）、（3）計算：

式中：A412nm為吸光度；D為稀釋倍數；c為蛋白質量/mg；V為溶于0.5 mol/L NaOH溶液的體積/mL。

1.3.6.3 溶解率

參考Benjakul等[24]方法。取不同發酵時間的魚糜凝膠（發酵0 h為對照組）1 g，加入20 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含1 g/100 mL SDS、8 mol/L尿素和體積分數2% β-巰基乙醇，pH 8.0），均質后混合物于100 ℃加熱2 min后，于室溫攪拌4 h，10 000×g離心30 min。取上清液10 mL，添加50 g/100 mL的冷TCA至終質量分數為10%，混合液于4 ℃放置18 h，10 000×g離心30 min，沉淀物用10 g/100 mL TCA沖洗并溶解于0.5 mol/L NaOH溶液中。總蛋白含量為魚糜凝膠直接溶解于0.5 mol/L NaOH溶液中測得的蛋白質含量。溶解率表示為溶解于溶劑中的蛋白質占總蛋白含量的百分比。蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法。

模板質量直接關系到模板的順利拼裝及墩身外觀質量，安全前應嚴格對模型進行驗收檢查，不合要求的堅決返工補修。檢查驗收完畢后應對模板進行試拼，測量模板誤差對垂直高度的影響，檢查模板拼裝誤差。可提前采取措施減少模板在墩身上的調整量。安裝模板前，應先確定爬架懸掛預埋件位置，通過爬架系統上設置的模板可滑動調節系統，快速完成模板安裝。

1.3.7 肌原纖維蛋白分析

參考李娜等[25]方法，將1.3.3節蛋白樣品與2×上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）等體積混合，100 ℃加熱10 min，常溫5 000×g離心1 min，采用4%濃縮膠和10%分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），進樣量10 μL，初始電壓80 V，待樣品進入分離膠后改為110 V。電泳完成采用考馬斯亮藍R250染色，醋酸乙醇溶液進行脫色。

1.4 數據處理

實驗重復至少3 次以上。采用SPSS進行統計分析，單因素ANOVA方差分析，Duncan’s組間差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中pH值的變化

從圖1可知，未經發酵的秘魯魷魚糜pH值接近中性，發酵24 h后pH值大幅度降低至5.17，隨后一直小幅度下降至4.57，說明乳酸菌能利用魷魚肉糜快速繁殖，在發酵24 h后產生了大量有機酸。

圖1 發酵過程中魷魚糜凝膠pH值的變化Fig. 1 Change in pH of giant squid surimi gel during fermentation

2.2 魚糜凝膠特性在發酵過程中的變化

表1 秘魯魷魚糜發酵過程中凝膠特性變化Table 1 Changes in gel properties during fermentation of giant squid surimi

由表1可知，未經發酵的對照組沒有形成凝膠，無法通過質構儀測得其凝膠特性指標。發酵24 h后，魚糜凝膠硬度、彈性、膠黏性和咀嚼性達到最大，隨后該幾項指標持續下降，其中硬度、膠黏性和咀嚼性在24～30 h階段都有明顯下降，在隨后發酵時間里下降變化并不明顯，而彈性下降變化顯著。在發酵24 h凝膠強度為1 058.925 g·mm，30 h大幅度增加，達到1 504.479 g·mm，至36 h凝膠強度稍有下降至1 468.134 g·mm，到42 h呈較大幅度減少。綜合以上結果，24～36 h發酵階段內的魷魚糜凝膠特性最佳。

2.3 發酵過程中化學作用力的變化

2.3.1 離子鍵、氫鍵及疏水相互作用的變化

離子鍵是蛋白質分子所帶電荷使蛋白分子間相互吸引或者排斥的作用力，參與肌球蛋白分子尾部螺旋結構的相互交聯過程；氫鍵是弱偶極鍵，在蛋白質凝膠體系中的數量極大，是增加凝膠強度的重要化學鍵，對穩定結合水起重要作用。疏水相互作用是當蛋白質變性展開時，非極性多肽會暴露于分子表面，內部肌球蛋白分子尾部的疏水結構也暴露于水中，相鄰多肽非極性片段的疏水部分開始緊密結合，發生的疏水相互作用，可以引起蛋白質凝集形成凝膠[26]。

圖2 離子鍵、氫鍵及疏水相互作用隨發酵時間的變化Fig. 2 Changes in contents of ion bond, hydrogen bond and hydrophobic interaction during fermentation

如圖2所示，離子鍵在發酵魷魚糜凝膠形成過程中含量總體大幅度下降，最初質量濃度為1.706 g/L，經48 h發酵，質量濃度持續大幅度減少至0.196 g/L；而氫鍵初始含量比離子鍵少，在24 h稍有減少后大幅增多，到36 h質量濃度達到最大，為2.634 g/L，隨后至48 h稍有下降；疏水相互作用在該過程中含量總體均高于離子鍵和氫鍵，0～30 h階段含量持續較大幅度增大，至30 h質量濃度達到最大，為5.397 g/L，隨后36、42 h雖然有所下降但含量依然高于0 h未經發酵組。上述結果表明，發酵過程中離子鍵對凝膠形成維持并不起作用，氫鍵和疏水相互作用是維持凝膠形成的主要作用力。

2.3.2 二硫鍵的變化

圖3 二硫鍵隨發酵時間的變化Fig. 3 Change in disul fide bond content during fermentation

如圖3所示，隨著發酵時間延長，二硫鍵含量呈逐漸增多趨勢，在24、30 h含量較少，只有0.43 μmol/g和0.63 μmol/g，到36 h驟增至2.65 μmol/g，隨后增長速率放緩，至48 h含量為3.59 μmol/g，高于對照組。二硫鍵主要形成于30～36 h發酵階段，作用于魷魚糜凝膠形成及維持。

2.3.3 非二硫共價鍵的變化

非二硫共價鍵是凝膠形成過程肌肉組織中的內源性谷氨酰胺轉氨酶催化形成以ε-（γ-Glu）-Lys為主的共價交聯鍵，促進蛋白質凝膠網絡的形成。含SDS、尿素和β-巰基乙醇的混合溶劑能夠斷裂魚糜凝膠中除了非二硫共價鍵外的所有化學鍵，因此溶解率與形成的ε-（γ-Glu）-Lys等非二硫共價鍵的含量呈負相關。

圖4 溶解率隨發酵時間的變化Fig. 4 Change in solubility during fermentation

如圖4所示，發酵過程中，溶解率隨發酵時間延長逐漸降低，說明非二硫共價鍵在該過程中逐漸形成，尤其是30～36 h階段，溶解率從17.16%大幅度降低至9.45%，非二硫共價鍵主要在該階段形成。所以，非二硫共價鍵也形成于30～36 h，同樣作用于魷魚糜凝膠形成和維持。

2.4 肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析

圖5 發酵過程中肌原纖維蛋白變化SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the changes of myofibrillar proteins during the fermentation process

如圖5所示，肌原纖維蛋白中肌球蛋白重鏈和肌動蛋白發酵至24 h后條帶強度開始減弱，且隨著發酵時間延長，肌球蛋白至36 h已完全降解。同時，在發酵24 h后，于100～135 kDa范圍內出現新的鹽溶性蛋白條帶，在30～42 h發酵階段條帶呈增強趨勢，至48 h逐漸降解。文獻[27]報道，酸性條件下肌肉組織中酸性內源蛋白酶可被激活，將肌動球蛋白降解；肌動球蛋白的消亡以及新的鹽溶性蛋白條帶出現，結合2.2節結果分析推斷，新產生的蛋白條帶可能是由肌球蛋白重鏈被內源蛋白酶降解產生，是形成彈性凝膠體的重要組成部分。

3 討 論

pH值通過影響肌原纖維蛋白氨基酸側鏈電荷分布，改變蛋白質分子間的相互作用，可導致蛋白質結構及誘導凝膠形成的化學作用力發生變化[28]。肌原纖維蛋白等電點約為5.0～5.5[29]，當pH值接近肌原纖維蛋白等電點時，氨基酸側鏈正負電荷互相中和，蛋白質分子間離子鍵含量減少，這有利于疏水相互作用的增強與蛋白分子間的氫鍵作用增強，而遠等電點時，離子鍵含量增多，蛋白分子間形成斥力，疏水相互作用和蛋白分子間的氫鍵作用減弱，蛋白與溶質水間的氫鍵形成。同時，蛋白分子結構的變化會暴露出更多，活性巰基被氧化形成二硫鍵，以及在內源性谷氨酰胺轉氨酶的催化下會形成以ε-（γ-Glu）-Lys為主的共價交聯鍵。這一系列的變化都會影響魚糜凝膠品質的形成。

在發酵秘魯魷魚糜過程中，棒狀乳桿菌Lz153大量繁殖產酸，pH值降低接近等電點，因此，24～36 h內發生離子鍵迅速減少、氫鍵和疏水相互作用含量增大的變化。30～36 h階段二硫鍵和非二硫共價鍵含量均發生大幅度增加，這可能是因為魷魚組織中的內源蛋白酶在酸環境中被激活產生作用，導致蛋白質結構發生變化，暴露出更多活性巰基、賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸殘基上的γ-羧酰胺基，使得二硫鍵和非二硫共價鍵大量生成，同時，SDS-PAGE圖譜也出現肌動蛋白被逐漸降解、肌球蛋白重鏈至36 h完全降解并在30 h新蛋白條帶明顯生成的結果。36 h后，肌球蛋白重鏈被完全降解，同時氫鍵和疏水相互作用含量稍有下降，而二硫鍵和非二硫共價鍵則有增無減。許艷順等[30]研究發酵鰱魚糜凝膠形成機理和劉海梅等[31]探究鰱魚糜凝膠形成過程中化學作用力及蛋白質構象的變化中，疏水相互作用、二硫鍵和非二硫共價的鍵變化與本研究有同樣結果，而肌原纖維蛋白的變化與胡永金[32]對淡水魚糜發酵及凝膠形成機理研究的實驗結果類似。凝膠特性的測定結果（24～36 h凝膠特性最佳，隨后開始劣化）也印證了以上的推斷。本研究顯示，魷魚糜凝膠是肌原纖維蛋白和新出現的蛋白分子在氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵和非二硫共價鍵的共同作用下形成并維持，雷雨等[33]的研究同樣表示，非二硫共價鍵、疏水鍵及氫鍵可以促使魚糜形成更致密、均勻的三維網狀空間結構。

4 結 論

棒狀乳桿菌Lz153能在秘魯魷魚糜中快速繁殖產酸并使秘魯魷魚糜形成良好的凝膠體。該凝膠體在發酵24～36 h范圍內品質最佳隨后劣化。化學作用力變化規律為在發酵過程中離子鍵含量大幅度減少，氫鍵和疏水相互作用含量分別在發酵36 h和30 h達到最大值，二硫鍵和非二硫共價鍵含量隨發酵時間延長而呈增多的趨勢；SDS-PAGE圖譜顯示肌原纖維蛋白經發酵后，肌動蛋白和肌球蛋白重鏈均隨著發酵被降解，36 h后肌球蛋白條帶已完全消失，同時經發酵24 h后分子質量在100～135 kDa范圍出現了新的鹽溶性蛋白條帶，發酵至48 h也被降解。肌球蛋白和新出現的蛋白參與發酵魷魚糜凝膠網絡結構的形成，氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵和非二硫共價鍵是形成和維持發酵秘魯魷魚糜凝膠網絡的主要作用力。由于化學作用力對其作用的過程比較復雜，乳酸菌發酵魷魚糜凝膠形成的機理有待從蛋白質二級結構變化角度進一步研究。