基于氣相色譜-質譜技術與多元統計分析對不同栗香特征綠茶判別分析

尹洪旭，楊艷芹，姚月鳳，張銘銘，王家勤，江用文，袁海波,*

（1.中國農業科學院茶葉研究所 浙江省茶葉加工工程重點實驗室，浙江 杭州 310008；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

茶葉香氣是決定名優茶品質的重要因子之一，協調而愉快的香氣不僅是評價名優綠茶等級的標準，也是消費者選擇的重要依據。栗香是優質綠茶所擁有的特征香型之一，主要表現為熟栗子或嫩玉米的香氣特色，與鮮葉品種、原料品質和加工工藝等有關。隨著感官技術的日趨成熟和細化，根據栗香香型表現、香氣強度等感官表征上的差異，現代感官評審中又將栗香細分為嫩栗香、板栗香、熟栗香等不同香型[1-3]。板栗香是一種基于特定品種的堅果香氣，多見于制作中火功恰到好處的高檔綠茶及個別品種茶[4]；嫩栗香是在栗香風味的基礎上，突顯柔和、新鮮幽雅的毫茶香，多見于原料幼嫩、采制精細的高檔綠茶；熟栗香一般在足火的加工條件下，形成一種由栗香到高火香過渡的香氣特征。

目前茶葉香型的辨別主要依靠人工感官審評，結果存在個體誤差且需要豐富的經驗。因此，為使不同栗香特征的綠茶分類更科學直觀，利用現代儀器分析對茶葉香氣進行分析檢測，結合多元統計分析技術，對栗香綠茶香氣品質進行評價和預測是行之有效的方法。主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和系統聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）是目前食品領域比較常見的多元統計技術，廣泛應用于白酒[5-6]、龍眼[7]、橄欖油[8]等食品真假判別、質量評價[6]和年份產地鑒別[9]等方面。Jumtee等[10]采用真空水蒸餾法-質譜聯用分析日本煎茶的香氣組分，通過PLSDA與茶葉感官評價建立回歸，實現了對不同煎茶等級的有效區分，并得到15 種對日本煎茶香氣品質貢獻大的香氣組分。本研究將PCA、PLS-DA和HCA多元統計方法用于對不同栗香特征綠茶的香氣特征判別分析，并探索其相關性大的香氣物質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同栗香風味綠茶共有18 個，其中嫩栗香7 個，熟栗香5 個，板栗香6 個，樣品具體信息如表1所示。

表1 栗香型綠茶樣品信息Table 1 Detailed information about chestnut-like green tea

1.2 儀器與設備

7000C-7890B型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；250 mL自制頂空微萃取瓶、固相微萃取（solid phase micro extraction，SPME）手柄、DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supe1co公司；電加熱磁力攪拌恒溫夾套 無錫順潤公司；NaCl溶液（1 mg/mL） 山東佰鴻有限公司；癸酸乙酯 梯希愛化成工業發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官審評

建立5 人感官審評小組，3 男2 女，小組成員均具有國家中級評茶員及以上資質的專業人員。感官審評標準依照茶葉感官審評方法GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》沖泡[11]，主要對綠茶香氣特征進行審評，審評順序為熱嗅香氣、溫嗅香氣、冷嗅香氣，具體方法：撮取3 g茶倒入審評杯內，用沸水（100℃）充至杯滿（約150 mL）為止，浸泡4 min，隨后將茶湯瀝入審評碗內，聞其杯內香氣，評其術語，判斷香型。審評結果由審評小組一致通過獲得，反復3 次，遵循少數服從多數原則，最后確定其香氣類型。

1.3.2 樣品前處理

稱取10.0 g茶樣放入250 mL三角瓶中，沖入100 ℃超純水100 mL（物料比1∶10），加入1 mg/mL NaCl電解質溶液和癸酸乙酯作為內標物，用已打孔的橡皮塞（經丙酮浸泡12 h，去味）塞緊，磁力攪拌速率450 r/min，在60 ℃恒溫夾套內攪拌加熱，水浴平衡5 min后，將裝有DVB/CAR/PDMS萃取頭（實驗前老化5 min）的SPME手持器透過瓶蓋的橡皮塞插入自制頂空微萃取瓶，于茶湯液面上空吸附60 min，萃取完成后迅速將萃取頭放入氣相色譜-質譜聯用儀進行熱脫附解吸。

1.3.3 氣相色譜-質譜條件

氣相色譜條件：采用D B-5 M S毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），進樣口溫度：230 ℃，柱流速： 1 mL/min，不分流。程序升溫參數：50 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升到230 ℃，保持2 min。

質譜條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，轉接口溫度280 ℃，電子倍增器電壓350 V，質量掃描范圍35～400 u。

1.3.4 定性分析

定性分析通過安捷倫自動質譜解卷積定性系統，解卷積參數峰寬設為20，分辨率、靈敏度及色譜峰形的要求均設為中等，匹配因子最小值設置為80，譜圖檢索NIST14，同時結合文獻輔助定性。定量分析通過化學工作站數據處理系統，按峰面積歸一化法進行計算，求出各組分的相對含量。質量控制：加入癸酸乙酯對整個萃取和檢測過程進行監控，保證每個樣品圖中癸酸乙酯峰的保留時間變化率不超過1%，且峰面積變化率不超過10%。

計算各揮發物的保留指數（rentention index，RI），以正構烷烴混合物（C5～C26）為標準，在相同色譜條件下進行氣相色譜-質譜聯用分析并根據下式進行化合物的計算，與文獻RI值進行比對。RI篩選標準為RIi±20，RIi為文獻參考值。

式中：t’r（X）為待測化合物X的調整保留時間；t’r（Cn）為碳原子數為n的正構烷烴調整保留時間；t’r（Cn＋1） 為碳原子數為n＋1的正構烷烴調整保留時間；n為碳原 子數。

1.4 數據處理

SIMCA-P11.5（Umetrics，Sweden）用于PCA和PLSDA，IBM SPSS Statistics22用于HCA及比較香氣揮發物之間的差異性。

2 結果與分析

2.1 3 種栗香特征綠茶香氣成分分析和含量比較

表2 栗香綠茶中的揮發性化合物Table 2 Vlatile compounds in chestnut-like green tea samples

續表2

如表2所示，經過峰的篩選，去除柱流失和含鹵族元素的化合物，樣品共鑒定出85 個揮發性組分，主要包括醇類、芳香烴、醛類、酮類、烷烴類、萜烯類、酯類。其中烷烴類（19 種）種類最多，酮類（14 種）、萜烯類（11 種）次之，芳香烴類（4 種）最少。通過與文獻進行對比，發現有12 種香氣物質在栗香茶葉香氣研究中被檢測過[12-13]，包括3-蒈烯、芳樟醇、壬醛、水楊酸甲酯、2-甲基萘、茉莉酮、香葉基丙酮、（E）-β-紫羅蘭酮、δ-杜松烯、去二氫菖蒲烯、橙花叔醇、（Z）-己酸-3-己烯酯。在85 個共同化合物中，3 種香型茶樣相對含量較高的化合物（相對平均含量≥0.5%）主要有2,2,4,4-四甲基辛烷、（E）-3-丁酸己烯酯、2,3-二氫-2,2,6-三甲基苯甲醛、十二烷、癸醛、（Z）-正戊酸-3-己烯酯、1,2,3,4,4a,5-六氫-（1S,4S,-4aS）-1-異丙基-4,7-二甲基-萘、1,1,1-三甲基-1,2-二氫萘、（Z）-3-己酸己烯酯、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯、茉莉酮、十四烷、 （E）-β-紫羅蘭酮、2,4,6-三（1,1-二甲基乙基）-4-甲基環己-2,5-二烯-1-酮、去氫白菖烯、δ-杜松烯，這些成分對構成綠茶的特征風味有著重要的“基質”作用，是香氣特征主體成分[13-14]。

已有研究中，栗香通常認為與熱物理化學反應生成的吡嗪、吡咯類等焦糖香物質關聯性大[3,15-16]。本實驗檢測出6 種吡咯、吡嗪類物質，分別是2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基-吡嗪、2-乙基-6-甲基-吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪、3-甲酰基-4,5-二甲基吡咯、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪，體現所選茶樣的烘炒香風味。

圖1 不同栗香綠茶化合物相對含量對比Fig. 1 Comparison of the relative content of each class of volatile components in different chestnut-like green tea samples

如圖1所示，嫩栗香型綠茶萜烯類物質（14.52%）和醛類物質（5.56%）相對含量高于板栗香型綠茶，板栗香型綠茶醇類、芳香烴、酮類、烷烴類、酯類物質相對含量均高于嫩栗香型綠茶，而熟栗香型綠茶酯類物質相對含量達到59.54%，遠遠大于其余2 種香型，熟栗香在其余類物質含量均低于另外2 種香型。

（Z）-己酸-3-己烯酯和（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯2 種酯類物質，在熟栗香中相對含量分別達到22.50%和17.83%，遠大于嫩栗香和板栗香中含量，從表2可以看出，2 種物質在3 種香型中差異顯著。（Z）-己酸-3-己烯酯是綠茶常見的揮發性組分，呈現強烈彌散性梨香，對西湖龍井茶香氣的形成有顯著貢獻[11]；（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯是一種食品用香料，具有強烈的透發青香，帶有生梨果香的莖樣氣息。炒青茶殺青時間長，苯甲醇、香葉醇等高沸點成分及吡嗪、吡咯等焦糖香物質含量較高，通常具有栗香或清新的香氣[16]，與此同時，高溫作用使低沸點的物質進一步揮發，發生酯化反應，青葉醇與（Z）-3-己烯酸形成（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯，以芬芳的水果香參與形成茶香[17]。

2.2 多元統計分析

2.2.1 基于PCA對不同栗香特征綠茶的區分

圖2 PCA得分圖（A）和Hotelling T2分布圖（B）Fig. 2 PCA score plot (A) and Hotelling T2 value range plot (B)

近年來，隨著香氣檢測技術的發展和多元統計分析技術的普及，越來越多的統計分析方法應用于茶葉香型的化學識別[18-19]，香氣指紋圖譜的建立[20]，香氣特征成分的研究[21]等方面。PCA是一種基于最大統計學距離投影的降維方法，使用少量的綜合變量（主成分）來取代原先的復雜多變量從而能在最大程度保留數據原有信息的情況下，降低數據復雜度，并對數據進行可視化處理[22]。

利用全部栗香茶樣香氣組分的相對含量進行PCA，提取得到4個主成分，累計貢獻率為61.4%，基本可以表征所涉及的化學成分信息。如圖2A所示，3種不同栗香特征的綠茶樣品具有明顯的區域分布特征。由于PCA屬于無監督分析模式，沒有考慮樣本類別信息，對嫩栗香和板栗香2 種比較近似的香型區分不太明顯，但是18個樣品在99% Hotelling T2置信區間內，沒有發現“離群樣本點”，如圖2B所示，且有16個樣品在95% Hotelling T2置信區間內，表現出明顯的聚類趨勢。

2.2.2 基于PLS-DA對不同栗香特征綠茶的區分

和PCA相似，PLS-DA也是基于降維的多維向量分析方法，但是可以預設分類，其優勢是可以盡量去除未控制變量對數據分析的影響，進一步挖掘數據中的信息，同時可以量化特征化合物造成組分差異的程度[23-25]。

以鑒定的85 個揮發性組分含量為X變量（表2），以18 個綠茶樣栗香特征為Y變量進行PLS-DA。由圖3A可以看出，18 個栗香茶樣根據其香氣特征被明顯區分， R2Y＝0.843，Q2＝0.694，說明該模型對3 種栗香特征綠茶具有良好的穩定性和較好的預測能力。將模型建立時定義的分類Y矩陣的變量隨機排列200 次，得到隨機的不同相應Q2值作為衡量模型是否過擬合的標準[26-27]。如圖3B所示，R2＝0.424，Q2＝－0.318，Q2負值表明該PLS-DA模型可靠，未存在過擬合現象，可以用于各自類別的判別分析。

圖3 PLS-DA得分圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig. 3 Score plot of PLS-DA (A) and plot of permutation test (B)

2.2.3 重要香氣組分分析

圖4 PLS-DA因子載荷圖（A）和VIP得分圖（B）Fig. 4 Loading plot of PLS-DA (A) and VIP scores (B)

因子載荷圖可以反映每一個變量在得分圖上的貢獻，分布越密集的變量對栗香分類的影響越小，反之，離密集區越遠的變量對栗香分類的影響越大。從圖4A可以看出，茉莉酮（No.70）、香葉醇（No.55）、3,6-二甲基-辛烷（No.56）、香葉基丙酮（No.74）、2-甲基萘（No.58）可作為嫩栗香型的特征揮發性組分；板栗香型與辛醛（No.10）、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛（No.41）、（E）-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯（No.32）和3-甲基-十一烷（No.39）的含量顯著相關，可作為板栗香型的特征揮發性組分；2,6,10-三甲基-十二烷（No.66）、1-癸醇（No.44）、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯（No.68）、（Z）-正戊酸-3-己烯酯（No.52）、（E）-3-丁酸己烯酯（No.42）和2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪（No.60）與熟栗香型綠茶距離更近，對熟栗香型有更好的辨別能力，可作為熟栗香型的特征組分。

變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）可以量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻，通常認為VIP大于1.0表示在判別過程中具有重要作用。VIP值越大，變量在栗香綠茶不同香型間的差異越顯著。由圖4B可以看出，有38 個揮發物VIP大于1.0可作為區分3 種不同栗香特征綠茶的標志物，特別是癸烷（No.9）、2,2,4,6,6-五甲基-庚烷（No.4）、去二氫菖蒲烯（No.81）、茉莉酮（No.70）、δ-杜松烯（No.80）、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛（No.41）、（Z）-3-己酸己烯酯（No.67），其VIP大于1.4，在區分3 種不同栗香特征的綠茶時尤為重要。

2.2.4 基于HCA對不同栗香特征綠茶的區分

圖5 不同風味栗香茶的聚類分析樹狀圖Fig. 5 Dendrogram for chestnut-like green tea constructed using Ward’s linkage

如圖5所示，3種栗香香型綠茶可以在聚類距離12處被清晰地分成3 個聚類，其中Cluster I為熟栗香的香型聚類，Cluster II、Cluster III分別為嫩栗香和板栗香的聚類。此外，嫩栗香和板栗香在約14的距離可以聚合成一個聚類，說明在3 種香型中嫩栗香和板栗香在香型距離中更近，相似度更高，這與審評小組在審評過程中的感官印象一致：嫩栗香和板栗香更像一種水煮板栗的香氣特征，而熟栗香更接近高火香的茶香。在專業審評書籍上將板栗香和嫩栗香視為同一種香氣，由此可見，聚類效果和感官辨識基本一致[4]。

3 討 論

本實驗用氣相色譜-質譜聯用結合多元統計分析技術實現對3 種不同栗香特征綠茶的有效識別。通過PCA提取4 個主成分，累計方差貢獻率為61.4%，基本可以表征所涉及的化學成分信息。結果表明，3種不同栗香特征的綠茶樣品具有明顯的區域分布特征。PLS-DA中，18個栗香茶樣根據其香氣特征實現良好分離，R2Y＝0.843，Q2＝0.694，說明該模型對3 種栗香特征綠茶具有良好的穩定性和較好的預測能力；通過置換檢驗發現，R2＝0.424，Q2＝－0.318，表明該模型可靠。通過HCA，3種栗香香型綠茶可以在聚類距離12處被清晰地分成3 個聚類，其中板栗香型和嫩栗香型距離更接近，和人工感官結果相似。

茉莉酮、香葉醇、3,6-二甲基-辛烷、香葉基丙酮、2-甲基萘、對嫩栗香型有更好的辨別能力，可作為嫩栗香型的特征性組分；在以往研究中，茉莉酮、香葉醇、香葉基丙酮、（Z）-3-己酸己烯酯已經被多次論證為龍井茶特征風味物質[28]。茉莉酮呈茉莉花香，香葉基丙酮呈現果香、清香[14]，香葉醇具有薔薇系溫和的花香，香葉醇是綠茶中典型的風味物質，其含量與茶樹的品種、加工方法、鮮葉老嫩有關[29]。

辛醛、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛、（E）-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯和3-甲基-十一烷可作為板栗香型的特征性組分；辛醛在朱蔭等[13]研究中也有出現，有研究證明，脂肪醛大多呈現濃烈的果香風味，還帶些許面包氣。

熟栗香型與2,6,10-三甲基-十二烷、1-癸醇、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯、（Z）-正戊酸-3-己烯酯、（Z）-3-己酸己烯酯、（E）-3-丁酸己烯酯和2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪含量顯著相關，可作為熟栗香型的特征性組分。酯類化合物大多呈現輕微果香，（Z）-己酸-3-己烯酯則呈現強烈的彌散性梨香，對西湖龍井的香氣特征形成具有顯著作用。萜烯類化合物是茶葉香氣的重要組成部分，單萜及倍半萜大都帶有濃郁的甜香、花香和木香，是各類茶的主要香氣成分[30]。

綜上可知，茉莉酮、香葉醇、香葉基丙酮、2-甲基萘可作為嫩栗香型的特征性組分，辛醛、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛、（E）-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯可作為板栗香型的特征性組分，1-癸醇、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯、（Z）-正戊酸-3-己烯酯、（Z）-3-己酸己烯酯、（E）-3-丁酸己烯酯和2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪可作為熟栗香型的特征性組分。

根據VIP大于1.0篩選出38 種對不同栗香綠茶進行有效區分的標志物，特別是癸烷、2,2,4,6,6-五甲基-庚烷、去二氫菖蒲烯、茉莉酮、δ-杜松烯、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛、（Z）-3-己酸己烯酯，其VIP大于1.4，而且這7 種物質存在顯著差異（P＜0.05），因此這7 種物質在區分3 種不同栗香特征的綠茶過程中發揮著重要作用。

此外，大多數高含量的組分（相對平均含量≥0.5%）多集中于揮發性物質譜圖的中后部，證明栗香香型綠茶揮發性物質大多為中高沸點的化合物，這與葉國柱等[31]的研究推斷一致，在16 種相對高含量的共同化合物中，有4 種酯類、4 種烯類、3 種酮類、2 種醛類和3 種烷烴類，其中酯類物質的含量顯著大于其他幾類物質，相對含量達到31.26%，可推測，炒干過程中高溫作用使低沸點的物質發生酯化反應，形成的大分子質量酯類，以及在加熱水解條件下萜苷類發生環化、脫水、異構化釋放的烯醇、烯醛、萜烯構成了栗香綠茶風味特征的主體物質。