紅棗白蘭地中特征風味物質的感官組學

任曉宇，鎖 然*，裴曉靜，王 頡，王珺瑫，張少云，謝立娜

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

紅棗白蘭地[1]是一種蒸餾酒，它以紅棗為原料，經過發酵、蒸餾、橡木桶貯藏陳釀而成，乙醇質量分數達40%～80%[2]。它在制作過程中不經過任何的勾兌，大多數是由家庭式作坊制造，并且在制造過程中，產生了豐富而且復雜的香氣物質。

香氣成分是影響酒品質的一個重要因素，它主要受一些復雜芳香化合物的影響。夏亞男等[3]采用頂空固相微萃取（headspace-soild phase microextraction，HSSPME）鑒定出紅棗白蘭地中85 種香氣化合物，其中以酯類最多。張文葉等[4]采用同時蒸餾萃取鑒定出干紅棗酒中53 種香氣化合物。李樹萍等[5]通過氣相色譜-質譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）聯用技術共鑒定出了56 種香氣化合物，其中酯類物質較多。李丹等[6]采用液液萃取法鑒定出金絲小棗酒中35 種香氣化合物，其中以醇類物質最多。

采用HS-SPME與GC-MS聯用測定紅棗白蘭地的香氣成分的研究較少，而且用感官組學分析方法對紅棗白蘭地的研究鮮有報道。感官組學[7]是近年提出來的，在分子水平上研究食品感官質量的多學科交叉技術。它的核心內容是在分子水平上定性、定量和描述分析，并精確構建食品的風味重組物[8]。目前，對于香氣的研究技術不僅包括GC-O和定量分析，而且包括一些感官組學研究，比如香氣活性值（odor activity value，OAV）、香氣描述分析、香氣萃取物稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）[9]、香氣重組與香氣遺漏實驗[10]。它們被廣泛而且成功應用于研究食品中的特征香氣成分，如威士忌、啤酒、中國米酒及其他食物[11-14]。

本實驗通過GC-O-MS聯用對紅棗白蘭地中的香氣成分進行分析，通過香氣描述分析、AEDA確定紅棗白蘭地中的香氣成分，并且結合內標法測定每種化合物在酒中的含量，得出紅棗白蘭地的主要組成成分；同時通過OAV確定每種香氣化合物的貢獻值，以及通過香氣重組、香氣遺漏/添加實驗進一步確定紅棗白蘭地中的特征香氣成分。該結果為紅棗白蘭地特征風味和品質控制提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗白蘭地成品酒（乙醇體積分數46%）生產于河北保定阜平；氯化鈉、碳酸氫鈉、硫酸、無水硫酸鈉（均為分析純） 天津市凱通化學試劑有限公司； 無水乙醇（色譜純） 美國阿拉丁試劑有限公司；3-辛醇（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷（分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；庚酸乙酯、月桂酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯甲醛、壬酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、苯丙酸乙酯、辛酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、癸酸甲酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、正丁醇、正戊醇、苯甲醇、苯乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、月桂酸、癸酸、辛酸、戊酸、苯乙酸、蘑菇醇、糠醛、庚酸標準品 美國TCI公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A GC-MS聯用儀、HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司； ODP3嗅聞儀 德國Gerstel公司；二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭、萃取手柄 美國Supelco公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；JJ200型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

1.3.1.1 液液萃取樣品處理

參考文獻[15]方法，取50 mL酒樣于分液漏斗中用煮沸的去離子水稀釋至乙醇體積分數10%，添加氯化鈉至飽和。用二氯甲烷在分液漏斗中分別萃取3 次，收集合并有機相。為便于GC-O和GC-MS分析，將濃縮后的有機相分成酸性/水溶性組分、中性組分、堿性組分3 個部分。

將萃取液氮吹濃縮至100 mL，加煮沸的去離子水50 mL。用加有氫氧化鈉的10%碳酸氫鈉溶液（pH 11）調整pH值至10，靜置分層，將水相記為萃取物1，有機相記為萃取物2。

萃取物1用2 mol/L H2SO4溶液調整pH值至2，用10 g NaCl飽和，用二氯甲烷萃取2 次，每次10 mL，合并萃取物，加入5 g無水硫酸鈉置于冰箱中干燥過夜后，氮吹至1 mL，記為“酸性/水溶性組分”。萃取物2用20 mL煮沸的去離子水洗一次，靜置分層，在分液漏斗中分離出水相和有機相，水相記為萃取物3，有機相記為萃取物4。萃取物3用二氯甲烷萃取2 次，每次10 mL，合并萃取物，加入無水硫酸鈉置于冰箱中干燥過夜后，氮吹至1 mL，記為堿性組分。萃取物4加入無水硫酸鈉，置于冰箱中干燥過夜后，氮吹至1 mL，記為中性組分。所有的萃取液供GC-O和GC-MS分析。

1.3.1.2 HS-SPME樣品處理

用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對揮發性香氣成分進行萃取。酒樣用煮沸的去離子水稀釋至乙醇體積分數為10%。在20 mL頂空瓶準確加入7.5 mL稀釋樣品，并加入25 μL的3-辛醇（300 mg/L）作為內標化合物，將已經老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空瓶中。樣品在50 ℃預熱15 min，萃取吸附40 min，吸附完成后，GC解吸6 min。

1.3.2 GC-O與GC-MS分析條件

GC條件：HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣；升溫程序：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min升溫至230 ℃，并保持15 min；載氣為高純氦氣，恒定流速為1.45 mL/min。

MS條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z30～450。

1.3.3 香氣強度測定

由4 名經過培訓的評價員在嗅聞口記錄得到風味的特征和強度，強度分別為0、1、2、3、4五個等級，其中0表示未聞到，1表示聞香程度微弱，2表示聞香程度中等，3表示聞香程度明顯，4表示聞香程度非常明顯，同時將聞到的香味進行描述，最終的聞香強度為每次記錄的聞香強度的平均值[16]。對香氣強度大于2的物質進行定量分析及OAV分析。

1.3.4 AEDA測定

參考文獻[17]方法，用二氯甲烷將濃縮萃取液按照體積1∶2n（n=1, 2, 3……）進行系列稀釋，每次稀釋后自動進樣1 μL用于GC-O分析，直到評價員在嗅聞口感覺不到氣味則停止稀釋。在最低的濃度條件下仍能聞到的成分被確定為樣品的關鍵香氣成分，通過AEDA法確定呈味化合物的稀釋因子。

1.3.5 香氣化合物的定性定量分析

定性分析：通過與NIST 14.L中的標準質譜圖進行比對，并結合GC-O共同確定香氣化合物。

定量分析：由于DVB/CAR/PDMS萃取頭對一些強極性的脂肪酸以及不易揮發物質的吸附性較差，因此選擇液液萃取對脂肪酸以及不揮發的物質進行定量[18]。參考文獻[18]的方法，將酒樣用煮沸的去離子水稀釋至乙醇體積分數為10%，取18 mL的稀釋液于密封性良好的20 mL樣品瓶中，加NaCl飽和，加入54 μL 3-辛醇（最終質量濃度為3 μg/mL），加入1 mL二氯甲烷進行萃取，取1 μL提取液進行GC-MS分析。HS-SPME定量易揮發的香氣成分，采用3-辛醇做內標，建立相應物質的標準曲線，通過標準曲線對香氣物質進行定量。

1.3.6 OAV的計算

OAV是用來評價各個香氣成分對酒的總體香氣貢獻，OAV是香氣物質的濃度與該物質的閾值之比[19]。通常情況下，OAV不小于1的物質對酒的總體風味具有貢獻[20]。根據文獻[21-24]查找每個香氣物質的閾值，再根據其含量進行計算得到香氣物質的OAV。

1.3.7 紅棗白蘭地的香氣重組實驗

以46%乙醇溶液作為重組基質，將紅棗白蘭地中OAV不小于1的香氣物質以自然濃度溶解在基質中[25]，最后在室溫條件下平衡10 min，得到一個完整的重組樣品。

選取10 名評價人員進行香氣成分描述（5 名男性和5 名女性，平均年齡30 歲），其中6 名來自GC-O分析的人員，另外4 名是熟悉白酒特征風味的實驗室工作人員。選擇7 個相關味道來描述酒中的香氣：水果、乙醇、蘑菇、酸味、花香、甜味、草味。評價人員根據香氣的強度進行評定（0～4），其中0表示未聞到，1表示香氣微弱，2表示香氣中等，3表示香氣較強，4表示香氣最強。每種香氣的強度值為10 名品評人員所聞強度的算術平均值，最后將所得結果做成雷達圖。

1.3.8 遺漏/添加實驗

根據文獻[26]的方法，通過3 組樣品測定確定某些化合物的顯著性。因此，準備14 種香氣遺漏模型，每一種模型是重組模型省略一個或者多個組分。給評估人員呈現3 個樣品，即一個省略模型和2 個完整重組模型。所有的樣品隨機編碼，要求評價人員通過嗅聞確定不同的樣品。根據文獻描述的方法[26]確定省略模型和完全重組模型之間差異的顯著性。

1.4 數據處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 紅棗白蘭地中香氣成分的GC-MS分析

表1 GC-O確定紅棗白蘭地中的香氣成分Table 1 Aroma compounds identi fied by GC-O in jujube brandy

續表1

由表1可知，在紅棗白蘭地中共檢測出63 種香氣化合物，包括酯類25 種、醇類14 種、酸類12 種、醛類5 種、酮類2 種、其他5 種。結果表明，在紅棗白蘭地香氣物質中酯類、醇類物質較多。根據文獻[27]可知，在酒的發酵、蒸餾和老化過程中醇和脂肪酸不斷形成酯類物質，而這些酯類物質對酒的香氣具有重要的作用。醇類物質是由原料中的蛋白質、氨基酸和糖類在發酵過程中生成[28]，它們賦予酒體醇香。醛酮類物質屬于不穩定的中間化合物，其數量較少，但也賦予酒體一定的香氣。酸類物質主要影響酒的口感。

由表1可知，乙酸異戊酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、3-苯丙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇具有較高的香氣強度，香氣強度為3。其中，3-苯丙酸乙酯（＞2 048）具有較高的稀釋因子，庚酸乙酯、丁二酸二乙酯稀釋因子分別為512、256，這些酯類物質都顯出較強的水果香氣；然而3-甲基-1-丁醇表現出不愉快的味道。丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯等酯類香氣強度都為2.75，其中丁酸乙酯（＞2 048）、2-甲基丁酸乙酯（＞2 048）都具有較高的稀釋因子，它們分別表現出橘子香味和水果香味；己酸乙酯、壬酸乙酯也具有相對高的稀釋因子（512），它們賦予酒體檸檬味、花香味；苯乙酸乙酯（256）表現出蜂蜜味；月桂酸乙酯（64）、異戊酸乙酯（32）、辛酸乙酯（32）和大多數酯類一樣，都賦予酒體水果香味。然而，月桂酸乙酯、己酸乙酯在其他酒中則表現出了較高的香氣強度[29-30]。其他一些香氣物質，如癸酸（難聞氣味）、萘（衛生球味）、亞油酸乙酯（奶油味）、苯甲醛（苦杏仁味），它們呈現出較低的香氣強度但同時也賦予酒體不同的風味，然而，在其他研究中也發現了這些風味物質[21]。

2.2 紅棗白蘭地中香氣成分的定量分析

表2 34 種香氣成分的標準曲線以及在紅棗白蘭地中的含量Table 2 Standard curves and concentrations of 34 odorants in jujube brandy

盡管GC-O能有效測定紅棗白蘭地中的香氣成分，但是它不能確定關鍵香氣成分。為進一步研究紅棗白蘭地中的香氣物質，將香氣強度大于2的34 種物質進行定量。如表2所示，在紅棗白蘭地中，異丁醇與3-甲基-1-丁醇的質量濃度最高，分別為2 024.38、1 359.48 mg/L，它們賦予酒樣醇香。同時，月桂酸乙酯（118.27 mg/L）、苯甲酸乙酯（34.69 mg/L）、丁酸乙酯（30.44 mg/L）、癸酸乙酯（26.34 mg/L）、苯甲醛（20.94 mg/L）、丁二酸二乙酯（14.89 mg/L）具有較高的含量，賦予酒體水果、甜香味。然而一些含量不高的香氣物質卻賦予酒體特殊的香氣，比如糠醛（8.42 mg/L），它賦予酒體苦杏仁味；亞油酸乙酯（3.12 mg/L）賦予奶油、花香味；1-辛烯-3-醇（2.12 mg/L）賦予蘑菇味；苯乙醇（1.2 mg/L）賦予玫瑰香味。因此，不同含量的物質賦予酒樣不同的香氣。

2.3 香氣成分的OAV分析

表3 紅棗白蘭地中34 種香氣成分的閾值以及OAVTable 3 Orthonasal thresholds and OAVs of 34 odorants in jujube brandy

由表3所示，在定量的34 種香氣物質中，有21 種化合物的OAV大于1，其中酯類物質13 種，醇類物質4 種，酸類物質3 種，醛酮類物質1 種。它們對紅棗白蘭地中的風味具有重要作用。其中2-甲基丁酸乙酯的OAV最大，具有水果香味，對紅棗白蘭地的香氣貢獻最大；其次是異戊酸乙酯（OAV=872.28）、辛酸乙酯（OAV=559.69）。丁酸乙酯、戊酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯OAV分別為373.5、222.76、184.8、182.28，共同賦予酒樣水果香味。1-辛烯-3-醇賦予酒樣蘑菇味，其OAV為346.41。3-苯丙酸乙酯（OAV=44.96）、苯乙酸乙酯（OAV=12.38）分別賦予酒樣花香味、蜂蜜味。然而對于OAV不大于1的香氣物質，對于酒樣整體香氣并沒有很大貢獻。

2.4 香氣重組與遺漏/添加實驗分析

表4 紅棗白蘭地完整重組中的遺漏/添加實驗Table 4 Omitted odorants in complete recombinant test

圖1 紅棗白蘭地的特征香氣與完整香氣重組的特征香氣Fig. 1 Aroma profile of jujube brandy and complete aroma recombinants

為進一步證實紅棗白蘭地中的特征香氣物質，根據定量結果進行香氣重組與遺漏/添加實驗。在46%乙醇溶液中分別加入OAV大于1的21 種香氣物質，構成重組模型，具體遺漏/添加香氣物質如表4所示。該評價小組由10 名經過訓練的評價者組成，通過對香氣強度的描述比較重組模型以及原液的香氣性質。結果如圖1所示，重組的香氣成分顯示出水果、草味、甜味、花香、酸味、蘑菇，乙醇味較原酒稍低。因此，重組模型與原液的香氣具有一定的相似性。結果表明，重組模型成功表現出所研究的紅棗白蘭地中的香氣。

由表4可知，所有的評價者都能夠識別出缺乏所有酯類物質的模型（模型1），從而可以判斷出省略模型1和完整重組之間具有高度差異性。因此，結果表明酯類所表現出來的水果香味對酒的整體香氣具有重要的作用。

由表3可知，2-甲基丁酸乙酯具有較高的OAV，但是當對其進行省略實驗時，10 個評估者只有4 個能正確識別出該化合物的缺失，與完全重組之間無顯著性差異，因此2-甲基丁酸乙酯不能作為紅棗白蘭地中的特征香氣物質。

研究結果表明，異戊酸乙酯、辛酸乙酯具有較高的OAV，因此，建立省略模型進行進一步的研究。當省略這2 種物質之外的所有酯（模型1E）時，無顯著性差異，因此可以表明這2 種物質對酒的整體香氣具有重要作用。當缺少異戊酸乙酯、辛酸乙酯（模型1D）時，具有極顯著差異。然而，當僅缺少異戊酸乙酯（模型1B）時無顯著性差異，但當缺少辛酸乙酯（模型1C）時具有高度顯著性差異，因此辛酸乙酯比異戊酸乙酯對酒的整體香氣具有更重要的作用。

當省略所有醇（模型2）時只有6 個評估者感覺到，因此無顯著性差異。但由表3可知，1-辛烯-3-醇、異丁醇具有較高的OAV，因此對他們分別做省略模型。當省略1-辛烯-3-醇時（模型2A），有7 個評價者能感覺到，因此可知1-辛烯-3-醇的蘑菇味對酒的香氣具有顯著影響。當省略異丁醇（模型2B）時只有4 個評價者能感覺到，因此異丁醇對酒的香氣并沒有很大的作用。雖然3-甲基-1-丁醇、正丁醇OAV較低，但缺少這2 種物質時（模型2C）具有極顯著差異，因此可知3-甲基-1-丁醇、異丁醇的醇香味對酒的風味具有一定的作用。

脂肪酸賦予酒酸味以及奶酪味，由表4可知，當缺少所有脂肪酸（模型3）時無顯著性差異。但是缺少戊酸（模型3A）時具有極顯著性差異，因此可知戊酸對酒的香氣具有重要的作用。當缺少3-甲基丁酸（模型3B）時無顯著性差異，由此可知它對酒的香氣并沒有重要作用。

當缺少芳香族化合物（模型4）時無顯著性差異，可能是由于過多的酯類物質掩蓋其芳香物質所特有的香氣，所以不能被評價者識別出來。在GC-O過程中，苯甲醛賦予酒苦杏仁味并且具有一定的強度，因此對苯甲醛（模型5）做遺漏實驗，但只有3 個評估人員覺察到它的缺失，因此可知苯甲醛對酒的香氣并沒有重要的作用。

3 結 論

本研究采用液液萃取、GC-O時間強度法、AEDA結合OAV、香氣重組與遺漏/添加實驗的相關分析，對紅棗白蘭地中的香氣成分進行分析。通過GC-MS與GC-O共同鑒定出63 種香氣化合物，其中包括酯類25 種、醇類14 種、酸類12 種、醛類5 種、酮類2 種、其他5 種。通過香氣強度實驗和AEDA實驗可以確定3-苯丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯具有較高的香氣強度和稀釋因子，它們對酒的整體香氣具有一定的貢獻。對香氣強度大于2的34 種香氣物質進行定量分析及OAV分析可知，2-甲基丁酸乙酯具有較高的OAV，其次是丁酸乙酯、戊酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯，它們共同賦予酒體水果香味。用OAV大于1的21 種香氣物質進行重組實驗，該重組實驗成功模擬紅棗白蘭地。通過香氣遺漏/添加實驗最終確定出辛酸乙酯是紅棗白蘭地中的特征香氣，其次是2-甲基丁酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、正丁醇、戊酸。通過感官組學方法研究紅棗白蘭地中的特征香氣成分，明確了特征香氣成分對紅棗白蘭地整體風味的貢獻，為紅棗白蘭地酒品質的調控提供理論依據。