7 株野生葡萄酒酵母對‘桂葡3號’干白葡萄酒香氣成分的影響

余 歡，管敬喜，楊 瑩*，黃曉云，成 果，謝太理，謝林君

（廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧 530007）

‘桂葡3號’是歐美雜交種葡萄“金香（Vitis vinifera×Vitis labrusca）”中選育出的芽變新品種。成熟時果皮金黃，可溶性固形物含量高，果香濃郁，適合釀造南方特色優質干白葡萄酒[1]。其平均單果粒質量5.5 g，且果實肉囊較多[2]，出汁率較低（50%～55%）[3]。

葡萄酒的芳香物質在葡萄酒風格與質量評價中起著重要作用，其中葡萄果實、釀造前處理、釀酒酵母及陳釀過程[3-9]的相關香氣物質起決定作用。研究發現葡萄酒中的揮發性物質主要包括酯類、醇類、醛酮類、萜烯類、硫醇類等，而關鍵呈香物質只是其中的小部分[10-11]。在葡萄酒風味物質形成過程中，酵母起主要作用，而不同酵母代謝途徑不同，從而使葡萄酒具有不同的風味特征[12-14]。

由于葡萄原料、釀造工藝等相同或相似，使國內葡萄酒產品有嚴重的同質化現象，而程序化使用商業活性干酵母讓葡萄酒沒有地方特色。研究人員發現解決葡萄酒同質化問題，關鍵在于采用不同酵母釀造葡萄酒[15]，通過選擇適應當地自然環境和葡萄品種的野生酵母釀造葡萄酒，使葡萄酒具有獨一無二的地方特色[16]。

前期實驗從廣西毛葡萄產區分離篩選得到7 株野生葡萄酒酵母，經鑒定為漢遜酵母屬的Hanseniaspora thailandica MSF1-4、伊薩酵母屬的Issatchenkia terricola MG3-1、釀酒酵母屬的Saccharomyas cerevisiae MSF8-1、漢遜酵母屬Hanseniaspora thailandica MG4、漢遜酵母屬的Hanseniaspora opuntiae MG6、漢遜酵母屬的Hanseniaspora ocdidentalis MSF6-2、畢赤酵母屬的Pichia pastoris MG1[17]。為探究該7 株野生葡萄酒酵母是否對本地葡萄品種有良好的釀造特性，本實驗以7 株酵母菌發酵的‘桂葡3號’干白葡萄酒為材料，通過氣相色譜-質譜聯用對酒樣的揮發性成分檢測，采用主成分分析法對7 個酒樣的特征香氣成分進行分析比較，以期獲得有地方特色的葡萄酒酵母,為釀造有南方特色的葡萄酒提供酵母資源。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

‘桂葡3號’葡萄：2016年12月15日采摘自廣西農業科學院葡萄與葡萄酒研究所明陽雙季葡萄示范基地園（東經108°14’31.76’’、北緯22°51’34.86’’），2014年3月種植，樹勢健壯，無病蟲害發生。株行距為3.3 m×4.0 m，水平棚架栽培，采用“一字”型修剪方式，常規的水肥、噴藥等田間管理[18]。果實可溶性固形物質量分數為18.1%，總糖質量濃度為212.9 g/L，可滴定酸質量濃度為9.23 g/L。

從廣西河池市都安瑤族自治縣青盛鄉樹齡50 a以上的野生毛葡萄植株的漿果篩選得到的7 株野生葡萄酒酵母：MSF1-4、MG3-1、MSF8-1、MG4、MG6、MSF6-2、MG1[17]，純化后的單菌株在YPD液體培養基中活化1 d，將活化的菌液與30%無菌甘油以1∶1混合于1.5 mL離心管中，－80 ℃保藏。

商業葡萄酒釀酒酵母K1（Lalvin） 丹麥Lallemand公司。

YPD液體培養基：1 L培養基中含有10 g酵母浸粉、20 g蛋白胨和20 g葡萄糖。YPDA固體培養基：1 L培養基中含有10 g酵母浸粉、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖和20 g瓊脂。

1.2 儀器與設備

LRH-250-MS霉菌培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司；SW-CJ-IFD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DW-86L388超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；5810R臺式高速大容量冷凍離心機 德國Eppendorf公司；UV-2700紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HV-110高壓滅菌鍋 日本Hirayama 公司；SCION SQ 456-GC單四極桿氣相色譜-質譜聯用儀、DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將－80 ℃冷凍保藏的7 株酵母于常溫解凍后，28 ℃ YPDA固體培養基劃線培養24 h后重復活化1 次。將菌落特征明顯的酵母菌株接種于YPD液體培養基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養24 h，培養物6 000 r/min離心10 min[19]，加無菌水混合后離心洗滌2 次，收集菌體，4 ℃冷藏備用。

商業酵母K1參照使用說明進行活化。

1.3.2 發酵實驗

將機械除梗破碎后的‘桂葡3號’葡萄醪，裝入2.5 L發酵容器中，裝液量為1.7 L，添加SO2至其質量濃度為60 mg/L（即體積分數為6%的H2SO3），接著將發酵容器放置在20～25 ℃靜置[20]。將酵母分別按照107CFU/mL接入葡萄醪，28 ℃恒溫發酵，每組3 個重復，采用二氧化碳失重法監測發酵進程，直至發酵結束（連續2 d的發酵液質量濃度變化小于2 g/L）。發酵結束后收集葡萄酒，將樣品低溫（4 ℃）3 000 r/min離心20 min后去除殘菌，保留上清液于4 ℃冷藏[21]。

1.3.3 葡萄酒理化指標測定

參照GB 15037—2006《葡萄酒》分析測定葡萄酒中pH值、殘糖、滴定酸（以酒石酸計）、揮發酸（以乙酸計）、乙醇體積分數、總酚等基本理化指標。

1.3.4 葡萄酒中揮發性香氣成分提取檢測[22]

頂空-固相微萃取條件：取8 mL樣品置于20 mL頂空瓶中，頂空瓶中加入磁力轉子，加入10 μL 100 μg/mL的2-辛醇作為內標。將老化后的75 μm CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，45 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數據。

色譜條件：色譜柱為DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始溫度40 ℃保持4 min，以5.0 ℃/min升至90 ℃，保持0 min；再以10.0 ℃/min升至230 ℃，保持7 min；進樣溫度250 ℃，載氣為He，流速0.8 mL/min，不分流。

質譜條件：電子電離源，發射電子流80 μA，電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃，質量掃描范圍m/z30～500。

1.3.5 揮發性香氣成分的定性與定量分析

定性分析：香氣成分經氣相色譜-質譜分析鑒定后，通過計算機譜庫（NIST98）進行初步檢索及資料分析，再結合文獻[23-24]進行人工譜圖解析，從而確認香氣物質的各種化學物質。

定量分析：利用2-辛醇內標法進行定量。計算公式[25]如下：

1.4 數據統計與處理

通過SPSS 20.0（美國IBM公司）對酒樣的理化指標進行單因素方差分析（多組間比較采用One-Way ANOVA法，P＜0.05，差異顯著），并運用主成分分析對超過其閾值（大于1）的香氣物質進行分析。

2 結果與分析

2.1 主要理化指標分析

表1 ‘桂葡3號’干白葡萄酒的理化指標Table 1 Physicochemical characteristics of ‘Guipu 3’ dry white wine

由表1可知，8 個酒樣的pH值均在2.8～3.8之間。pH值表示葡萄酒中酸的強弱，對葡萄酒的穩定性和感官質量都起著非常重要的作用。葡萄酒的pH值一般在2.8～3.8之間，否則穩定性較差，各種病蟲害微生物均易生長繁殖。

總酸即葡萄酒中的所有可滴定酸，為揮發酸和固定酸的總和?？偹岷繉ζ咸丫频纳珴珊惋L味均具有不同的影響[28]。由表1可知，7 株野生酵母均具有一定的降酸能力，其中MG3-1降酸最強，而MG1降酸最弱。乙酸對葡萄酒的風味影響是負面的[27]，由表1可知，所有酒樣揮發酸質量濃度（以乙酸計）均小于1.2 g/L，符合GB 15037—2006要求，研究發現其質量濃度在0.2～0.7 g/L 左右較為適宜，而在0.7～1.1 g/L時，會讓葡萄酒產生酸敗感和溶劑味[26]。MG1酒樣的滴定酸顯著高于其他7 個酒樣說明其產酸能力最強；MG3-1酒樣滴定酸顯著低于其他酒樣，即其產酸能力最弱。

發酵結束后殘糖量低，說明酵母對糖的代謝轉化率高，發酵能力強[29]。乙醇發酵結束時殘糖量若大于4 g/L則表明發酵不徹底，有酸敗的危險[30]。由表1可以看出，8 個酒樣殘糖都較低，發酵都較徹底，沒有酸敗的風險。商用酵母K1的總酚含量最低，而單寧含量最高。

2.2 揮發性香氣物質分析

通過對7 種酵母與商用酵母K1的發酵酒揮發性物質分析檢測，共檢測到68 種香氣物質，其中包括3 種酸類、14 種醇類、22 種乙酯類、18 種其他酯類、6 種醛酮類、5 種萜烯類，見表2。

表2 不同酵母的發酵香氣成分及含量Table 2 Aroma compounds of wines fermented with different yeast strains μg/L

續表2 μg/L

2.2.1 酯類

酯類賦予葡萄酒濃郁的果香[31]。由表2可知，酒樣中共檢測到40 種酯類，其中乙酯類22 種，其他酯類18 種。由圖1可知，8 個酒樣的香氣物質主要為乙酯類。

MG1酒樣中共有18 種乙酯類，占香氣物質總含量79.03%；其他酯類9 種，占香氣物質總含量5.96%。其中辛酸乙酯54 300.00 μg/L，占乙酯類總量42.93%，為K1辛酸乙酯含量的15.66 倍。與K1酒樣相比，MG1酒樣含有亞油酸乙酯、乳酸乙酯、十五酸乙酯和辛酸正丁酯，而K1酒樣沒有。其中亞油酸乙酯具有降低膽固醇和血脂的作用，可預防或減輕脈粥樣硬化癥。

MG4酒樣中共有14 種乙酯類，占香氣物質總含量76.80%；其他酯類5 種，占香氣物質總含量8.29%。其中辛酸乙酯31 751.00 μg/L，占乙酯類總量46.05%，為K1辛酸乙酯含量的9.16 倍。與K1酒樣相比，MG4酒樣含有乙酸異戊酯，而K1酒樣沒有。

MSF1-4酒樣中共有18 種乙酯類，占香氣物質總量84.04%；其他酯類10 種，占香氣物質總量2.35%。其中辛酸乙酯67 300.00 μg/L，占乙酯類總量42.41%，為K1辛酸乙酯含量的19.41 倍。與K1酒樣相比，MSF1-4酒樣含有亞油酸乙酯、己酸丙酯、十五酸乙酯、辛酸3-甲基丁酯和辛酸丙酯，而K1酒樣沒有。

MSF6-2酒樣中共有20 種乙酯類，占香氣物質總量78.91%；其他酯類12 種，占香氣物質總量7.22%。其中辛酸乙酯48 900.00 μg/L，占乙酯類總量40.78%，為K1辛酸乙酯含量的14.10 倍。MSF6-2酒樣含有硬脂酸乙酯、十五酸乙酯、辛酸正丁酯、亞油酸乙酯、順式-2-丁烯酸乙酯、乙酸葉醇酯、水楊酸甲酯和辛酸-3-甲基丁酯，而K1酒樣沒有。

MSF8-1酒樣中共有15 種乙酯類，占香氣物質總量85.26%；其他酯類10 種，占香氣物質總量5.83%。其中辛酸乙酯為58 800.00 μg/L，占乙酯類總量44.20%，為K1辛酸乙酯含量的16.96 倍。與K1酒樣相比，MSF8-1酒樣含有辛酸正丁酯、辛酸-3-甲基丁酯和辛酸丙酯，而K1酒樣沒有。

MG6酒樣中共有17 種乙酯類，占香氣物質總量73.94%；其他酯類10 種，占香氣物質總量10.63%。其中辛酸乙酯為26 400.00 μg/L，占乙酯類總量40.91%，為K1辛酸乙酯含量的7.61 倍。與K1酒樣相比，MG6酒樣含有順式-2-丁烯酸乙酯和乙酸異戊酯，而K1酒樣沒有。

MG3-1酒樣中共有17 種乙酯類，占香氣物質總量79.00%；其他酯類12 種，占香氣物質總量5.44%。其中辛酸乙酯為48 100.00 μg/L，占乙酯類總量42.93%，為K1辛酸乙酯含量的13.87 倍。與K1酒樣相比，MG3-1酒樣含有乙酸葉醇酯、異戊酸乙酯、乙酯庚酯、辛酸正丁酯、水楊酸甲酯和乙酸異戊酯，而K1酒樣沒有。

2.2.2 醇類

醇類來源于酵母埃利希代謝途徑和酵母對相應醛類還原過程的次級產物[32-34]。葡萄酒中的高級醇質量濃度低于300 mg/L時，能提高酒的復雜感；而質量濃度超過400 mg/L時，影響酒的感官品質[35]。由表2可知，MG1、MG4、MSF1-4、MSF6-2、MSF8-1、MG6、MG3-1、K1酒樣中醇類分別有7、6、10、7、7、5、11 種和8 種。由圖1和表2可知，醇類含量由高到低為MSF1-4＞MG3-1＞MSF6-2＞MG1＞K1＞MG4＞MG6＞MSF8-1。8 個酒樣均含一定量苯乙醇，給酒樣帶來獨特的紫羅蘭香、丁香、茴香和玫瑰香味。

2.2.3 酸類

乙醇發酵過程帶來揮發酸，其含量由葡萄汁的營養水平、發酵環境和釀造酵母[35]決定。葡萄酒中的有機酸給葡萄酒帶來了奶酪味和脂肪味[37-38]。由表2可知，8 個酒樣共檢測出辛酸、月桂酸和癸酸3 種揮發酸。由圖1可知，酸類含量由高到低為MSF1-4＞MG1＞MSF8-1＞MG3-1＞MSF6-2＞K1＞MG6＞MG4。

2.2.4 醛酮類

醛類主要來源于微生物的發酵。氨基酸在酶作用下轉氨基或氧化脫氨基產生醛。由表2可知，8 個酒樣共檢測出癸醛、苯甲醛、壬醛、十二醛、大馬士酮、香葉基丙酮，共4 種醛類2 種酮類。由圖1可知，醛酮類含量由高到低為MG1＞MG3-1＞MSF8-1＞MSF6-2＞MSF1-4＞MG4＞MG6＞K1。

2.2.5 萜烯類

微生物合成萜烯類化合物是通過二磷酸異戊烯生物合成途徑合成的[39-41]。二磷酸異戊烯之間結合形成香葉基二磷酸、法呢基二磷酸、香葉基二磷酸，分別是形成單萜、倍半萜和二萜的前驅物。其他萜烯類化合物來源于這3 個前驅物的環化或二次修飾。由于萜烯類化合物的香氣閾值低，所以少量的萜烯對增加葡萄酒風味的豐富性起重要作用[42]。由表2可知，8 個酒樣共檢測出4-萜烯醇、香茅醇、芳樟醇、α-松油醇、玫瑰醚共5 種萜烯類。由圖1可知，萜烯類含量由高到低為MG6＞K1＞MG1＞MG3-1＞MG4＞MSF6-2＞MSF1-4＞MSF8-1。

圖1 ‘桂葡3號’干白葡萄酒各類香氣物質的種類及其含量Fig. 1 Various classes of aroma components and their relative contents in ‘Guipu 3’ dry white wine

2.3 關鍵揮發性香氣物質的OAV

表3 8 種酵母發酵‘桂葡3號’干白葡萄酒中揮發性物質的OAV（OAV＞1）Table 3 OAV values of volatile substances in ‘Guipu 3’ dry white wines fermented with eight yeasts (OAV ＞ 1)

為更準確地確定各種香氣物質對葡萄酒的香氣特征作用大小，通過查找文獻得到相關香氣物質的香氣活力值（odour activity value，OAV），進一步分析探討8 個酒樣中的關鍵揮發性香氣物質，OAV是由該物質的含量除以其閾值得到的[43]，研究發現OAV大于1的香氣物質對葡萄酒的風味特征作用明顯，且OAV越大對香氣特征作用越明顯，而OAV小于1的物質只起協香作用[44]。

由表3可知，共有19 種香氣物質的OAV大于1，主要是脂類、醛類和萜烯類。其中10 種物質（辛酸、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、壬醛、4-萜烯醇、玫瑰醚）OAV大于10，（辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯、壬醛、玫瑰醚）OAV大于100，2 種物質（己酸乙酯、辛酸乙酯）OAV大于1 000。這些物質被認為是發酵酒中必不可少的香氣物質，且含量最多的是酯類，說明酯類是本實驗酒樣中的特征香氣物質。

2.4 OAV的模擬計算結果

將葡萄酒中同類揮發性香氣成分歸為一組，并計算該組的OAV總和，即可對樣品的香氣輪廓進行模擬。由圖2可知，采用不同的酵母發酵獲得的‘桂葡3號’葡萄酒具有不同的香氣特征，但是8 個酒樣的香氣特征均是由乙酯類決定。

圖2 葡萄酒香氣輪廓圖（OAV＞1）Fig. 2 Wine aroma profile (OAV ＞ 1)

2.5 關鍵揮發性香氣物質的主成分分析

由表4可知，2 個主成分的總貢獻率為67.116%，其中主成分1的貢獻率為48.564%，主成分2的貢獻率為18.553%。

由圖3可知，MG3-1、MG1、MSF6-2發酵實驗組接近，其特征香氣物質為乙酸苯乙酯、壬醛、4-萜烯醇、芳樟醇、1-辛醇、1-癸醇，這些物質具有花香、玫瑰香、橙子花香、水果香等香氣；MG6的特征香氣物質為乙酸異戊酯、香茅醇，這些物質具有香蕉、薔薇花香、青草香；MSF8-1、K1、MG4發酵實驗組接近，其特征香氣物質為乙酸乙酯，其具有水果味；MSF1-4的香氣特征物質為玫瑰醚、月桂酸乙酯、辛酸、癸酸、癸酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸甲酯，這些物質具有奶酪味、香蕉、菠蘿、草莓、蘋果、梨、橘子、花香等香氣。其中K1、MG4發酵實驗組最為接近，MG6、MSF1-4發酵實驗組差異最大。以主成分1為基準，MSF1-4發酵酒明顯區別于其他酒樣，且其香氣特征物質的OAV為37 038.67，香氣物質質量濃度為188 818.00 μg/L，2 個指標在所有實驗組中均排第1；以主成分2為基準，MG1明顯區別于其他酒樣，且其香氣特征物質的OAV為30 376.81，香氣物質質量濃度為160 058.30 μg/L，2 個指標在所有實驗組中均排第2；說明MG1和MSF1-4發酵酒的香氣評價最好。

圖3 ‘桂葡3號’干白葡萄酒中OAV大于1的部分香氣化合物PCA圖Fig. 3 PCA graphs of aroma compounds (OAV ＞ 1) in ‘Guipu 3’ dry white wine

3 討 論

通過篩選地方酵母釀造葡萄酒是增加葡萄酒的地域特征的有效方法。Lopes等[47]篩選的本土釀酒酵母MMf9發酵酒中具有紫羅蘭、桉樹、胡椒等獨特的香氣，且酒的品質明顯優于商業酵母發酵酒。李艷等[48]從龍眼葡萄自然發酵篩選的釀酒酵母DHS-1發酵酒中苯乙醇含量高于安琪和BM45酵母發酵酒，能賦予葡萄酒紫羅蘭香、茴香、丁香和玫瑰香味。徐麗萍[49]篩選出的高產酯假絲酵母屬1#產酯量比本實驗漢遜酵母屬MSF1-4的少19.08%。

通過對7 株野生酵母釀造的‘桂葡3號’干白葡萄酒樣，與商業酵母K1發酵酒比較研究，對發酵酒的揮發性香氣物質進行分析檢測，共得到68 種共5大類香氣成分，包括3 種酸類、14 種醇類、22 種乙酯類、18 種其他酯類、6 種醛酮類、5 種萜烯類，比‘桂葡3號’葡萄漿果[15]多29 種香氣物質，其中酯類多出19 種，且總含量是‘桂葡3號’漿果的5.9 倍。辛酸乙酯是干白葡萄酒的重要香味物質。本實驗7 株野生葡萄酒酵母產辛酸乙酯能力均高于周金虎等[50]誘變篩選的高產辛酸乙酯地衣芽孢桿菌，其中漢遜酵母屬MSF1-4是該菌株的17.26 倍。同時相對于商業酵母K1，7 株野生酵母菌均具有較強的產辛酸乙酯（白蘭地香氣）的能力，其中漢遜酵母屬MSF1-4產辛酸乙酯能力最強；由于香氣物質的總量和OAV均排第1和第2，因此香氣評價最好的是漢遜酵母屬MSF1-4和畢赤酵母屬MG1；而商業酵母K1發酵酒的香氣物質總量（71 912.33 μg/L）和種類（41 種）均最低。結果均表明，該7 株野生酵母具有良好的產香特性，有一定的商業酵母開發潛力，在后續工作中可進一步展開商業酵母開發應用相關實驗，如組合菌株的釀造特性、產辛酸乙酯的基因及其控制機理等。