響應(yīng)面法優(yōu)化郫縣豆瓣中有機(jī)酸的提取工藝及HPLC 定量分析

于筱雨，方佳興，向 琴，車振明，劉 平，林洪斌,2,*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065）

郫縣豆瓣作為“川菜之魂”，其制作工藝被列為第二批國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄[1-2]。郫縣豆瓣由紅辣椒（二荊條）、蠶豆、小麥粉和鹽，經(jīng)傳統(tǒng)工藝發(fā)酵而成，色澤紅潤且醬香味十足，是川菜中最重要的調(diào)味料[3-5]。盡管郫縣豆瓣具有悠久的歷史和較高的知名度，深受大眾喜愛，但在國際市場上的競爭力仍無法與日本、韓國、美國等發(fā)達(dá)國家的發(fā)酵調(diào)味品相媲美[2]，主要因?yàn)檑h豆瓣傳統(tǒng)生產(chǎn)模式，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差及產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善等。由于地域限制，國外對郫縣豆瓣的研究幾乎沒有，國內(nèi)對郫縣豆瓣的研究主要集中在香氣成分分析[6]及后發(fā)酵期真菌細(xì)菌的演替變化分析[7-8]。郫縣豆瓣醬在日曬夜露的陳釀過程中，通過酶促和非酶促作用，形成了其獨(dú)特的風(fēng)味體系，且隨著陳釀時間的延長，酯類組分含量先增后減[9]。郫縣豆瓣中主要香氣化合物的鑒定有助于衡量豆瓣產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的優(yōu)劣和劃分產(chǎn)品的質(zhì)量等級，同時促進(jìn)郫縣豆瓣生產(chǎn)企業(yè)更有效地控制和優(yōu)化產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)[10]。想要得到完善的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，需要綜合考慮呈香呈味物質(zhì)，因此本實(shí)驗(yàn)立足于此，研究郫縣豆瓣中呈味有機(jī)酸的種類及含量。

有機(jī)酸主要在發(fā)酵過程中，由大分子物質(zhì)水解以及微生物作用產(chǎn)生，為發(fā)酵食品提供獨(dú)特的風(fēng)味[11]，因此是發(fā)酵食品一大重要研究方向。Choi等[12]研究不同原料的韓國醬油中有機(jī)酸含量的變化；Park等[13]研究大豆醬中有機(jī)酸的種類及含量。然而鮮見關(guān)于郫縣豆瓣中有機(jī)酸的研究，因此有機(jī)酸的定性定量分析在郫縣豆瓣呈味研究中具有重要意義。測定有機(jī)酸常用方法有滴定法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）以及高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）法[14]。本研究針對郫縣豆瓣中呈味有機(jī)酸，采取響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并通過準(zhǔn)確度高且易操作的HPLC法分析呈味有機(jī)酸種類及含量。有機(jī)酸作為郫縣豆瓣中一種重要的呈味物質(zhì)，是重要的產(chǎn)品屬性之一，因此，定性及定量分析郫縣豆瓣中含有的呈味有機(jī)酸，為系統(tǒng)研究郫縣豆瓣呈味及風(fēng)味優(yōu)化研究奠定基礎(chǔ)，也為制定更加完善的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支撐，對郫縣豆瓣產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 種市售不同品牌（丹丹、鵑城、川老匯、川驕、川郫、旺豐）的一級郫縣豆瓣，置于4 ℃保存。

草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、富馬酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%），氫氧化鈉、乙醇成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

KH3200E超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TDZ5-WS離心機(jī) 上海盧湘儀器有限公司；BSA224S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；pHS-3C酸度計 成都市世紀(jì)方舟科技有限公司；MVS-1旋渦混合器 北京金紫光科技發(fā)展有限公司；e-2695 HPLC系統(tǒng) 日本W(wǎng)aters公司。

1.3 方法

1.3.1 乙醇溶液浸提有機(jī)酸的技術(shù)路線

郫縣豆瓣樣品→研磨→加溶劑旋渦振蕩→超聲浸提→離心→洗滌沉淀2 次→定容→待測液

1.3.2 有機(jī)酸提取量的確定

用移液管吸取待測液20 mL于50 mL燒杯中，用已標(biāo)定的NaOH溶液進(jìn)行滴定。滴定至pH計示數(shù)為8.2，記錄NaOH滴定液用量，根據(jù)消耗的標(biāo)定NaOH溶液量求出樣品中可滴定酸的含量[15]。計算公式如下：

式中：NaOH當(dāng)量濃度為0.101 3 mol/L；以檸檬酸作為其換算系數(shù)即0.064。

1.3.3 有機(jī)酸提取工藝優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[16-18]有機(jī)酸提取工藝優(yōu)化，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間3 個對郫縣豆瓣中有機(jī)酸提取量有較大影響的因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化有機(jī)酸提取工藝。

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

研究乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL））、超聲時間（15、30、45、60 min）對郫縣豆瓣中有機(jī)酸提取量的影響。

取5.0 g郫縣豆瓣充分研磨置于燒杯中，分別用一定體積分?jǐn)?shù)一定比例的乙醇，旋渦振蕩1 min，室溫超聲提取一定時間，3 500 r/min離心10 min，上清液收集于50 mL容量瓶中，分別用15、10 mL相對應(yīng)的乙醇溶液2次洗滌沉淀，離心，將上清液合并于容量瓶中，定容得到待測液。

1.3.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化范圍，參考響應(yīng)面分析因素與水平（表1），進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used for response surface analysis

1.3.4 有機(jī)酸定性及定量分析[19-20]

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：分別配制單一標(biāo)品及混合標(biāo)品。配制草酸、琥珀酸、富馬酸和乳酸標(biāo)品質(zhì)量濃度為0.5 g/L；配制酒石酸和蘋果酸標(biāo)品質(zhì)量濃度為1 g/L；配制檸檬酸標(biāo)品質(zhì)量濃度為2 g/L。然后配制與之相同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)品。

樣品的制備：取待測液5 mL，過強(qiáng)陰離子（SAX）小柱（預(yù)先用3 mL甲醇，3 mL去離子水活化），控制流速1～2 mL/min，棄去流出液。用5 mL蒸餾水淋洗凈化柱，再用5 mL 20%鹽酸溶液以不超過1 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液5 mL過0.22 μm微孔濾膜后，供HPLC分析。

色譜條件：色譜柱Aminex HPX-87H Ion Exclusion column（300 mm×7.8 mm，3 μm）；柱溫60 ℃；流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液；流速0.5 mL/min；采用光電二極管陣列檢測器；檢測波長210 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

采用Design-Expert v8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計分析，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以 ±s表示，采用S-N-K法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05），采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對有機(jī)酸提取量的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對有機(jī)酸提取量的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on extraction of organic acids

由圖1可知，有機(jī)酸提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈增加趨勢，但增加程度越來越小。有機(jī)酸多溶于水或乙醇，隨著乙醇含量的增加，會使一些脂溶性的色素或者親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些成分會與乙醇-水分子結(jié)合，使得有機(jī)酸溶出率受到阻礙，同時考慮到乙醇成本，最終選定60%～80%乙醇體積分?jǐn)?shù)作為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

2.1.2 料液比對有機(jī)酸提取量的影響

圖2 料液比對有機(jī)酸提取量的影響Fig. 2 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction of organic acids

由圖2可知，有機(jī)酸提取量隨提取試劑用量的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。一般來說，隨著溶劑的增多，提取率也會增加，但當(dāng)增加到一定量時，溶劑趨于飽和，此時再增加溶劑用量，不會增加有機(jī)酸的提取，反而可能使其他水溶性物質(zhì)溶出增加，阻礙有機(jī)酸與乙醇-水的結(jié)合。因此考慮有機(jī)酸提取率，選擇1∶15～1∶25（g/mL）料液比作為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

2.1.3 超聲時間對有機(jī)酸提取量的影響

圖3 超聲時間對有機(jī)酸提取量的影響Fig. 3 Effect of ultrasonication time on extraction of organic acids

由圖3可知，隨超聲時間的延長，有機(jī)酸提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。超聲有助于有機(jī)酸的提取，所以一定程度上，超聲時間越長，有機(jī)酸提取量越大，在超聲時間為30 min時有機(jī)酸提取量達(dá)到最大，超過30 min后，提取量隨時間延長而減小，可能因?yàn)殚L時間超聲處理使得揮發(fā)性有機(jī)酸含量減少，此外，超聲時間過長，能源消耗過大。綜上，選擇超聲時間20～40 min作為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選定因素與水平，以有機(jī)酸提取量為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化有機(jī)酸提取工藝，設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 有機(jī)酸提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3 模型的建立及方差分析

對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到的三元二次回歸方程為：Y=7.294×10－3＋1.538×10－4A＋1.125×10－5B＋1.075×10－4C＋4.500×10－5AB－5.750×10－5AC＋3.750×10－5BC－3.045×10－4A2－1.695×10－4B2－7.200×10－5C2。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for regression equation

由表3可知，模型P值為0.0147，該模型顯著，表明回歸模型達(dá)到顯著水平[21]。失擬項(xiàng)不顯著，相關(guān)系數(shù)R2值為0.4466，說明該模型與實(shí)際情況接近，即試驗(yàn)誤差小[22]，能充分反映出各因素之間的關(guān)系，因此，可用該方程對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由方差分析可知，因素A2影響極顯著（P＜0.01），A、BC、B2影響顯著（P＜0.05），模型中二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù)，表明該模型拋物面開口向下，有極大值點(diǎn)，也就是有機(jī)酸最優(yōu)提取點(diǎn)。

圖4 各因素交互作用對有機(jī)酸提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variable variables on organic acid extraction

各因素顯著程度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞超聲時間，通過優(yōu)化分析，最佳的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)71.96%、料液比1∶20.68（g/mL）、超聲時間37.04 min，預(yù)測有機(jī)酸提取量可達(dá)到14.7 mg/g，考慮到實(shí)際操作的局限性，將提取工藝條件優(yōu)化為乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、料液比1∶21（g/mL）、超聲時間37 min，在此條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次，郫縣豆瓣醬中有機(jī)酸提取量為14.58 mg/g，與預(yù)測值基本符合，證實(shí)該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性[23]。

2.4 有機(jī)酸定性及定量分析

圖5 7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品和2 種樣品HPLC圖Fig. 5 HPLC chromatograms of mixed standard solution of 7 organic acids and two samples

表4 有機(jī)酸保留時間及響應(yīng)值Table 4 Retention times and regression equations for organic acids

由圖5和表4可知，草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸和富馬酸的保留時間分別為7.8、9.4、10.0、11.2、13.3、14.9 min和15.7 min。有機(jī)酸作為郫縣豆瓣中呈酸味的主要呈味物質(zhì)，在6 種樣品中測得總有機(jī)酸含量分別為11.3（丹丹）、12.355（鵑城）、10.869（川老匯）、9.661（川驕）、9.278 mg/g（川郫）和12.031 mg/g（旺豐）。根據(jù)已有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵環(huán)境、微生物群體和原料大豆的來源都會對產(chǎn)品的有機(jī)酸種類與含量有重要影響[24]。如表5所示，6 種郫縣豆瓣樣品中檸檬酸含量最高，含量分別為4.828 3（丹丹）、6.3（鵑城）、5.134 2（川老匯）、4.197 8（川郫）、5.252 3 mg/g（川驕）和4.364 5 mg/g（旺豐），這個結(jié)果與Park等[13]在發(fā)酵醬制品中實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。郫縣豆瓣中檸檬酸可能由于曲霉的作用，有報道使用同位素標(biāo)記方法證明曲霉可以誘導(dǎo)某些酶和一些代謝途徑合成檸檬酸[25-27]。蘋果酸和草酸含量排在第2和第3，6 種樣品中蘋果酸含量在2.1～3.6 mg/g之間，草酸含量在1.7～2.4 mg/g之間。蘋果酸可能來自于郫縣豆瓣醬在發(fā)酵過程中，酶與糖發(fā)生復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)生蘋果酸[28]。韓國大豆醬中檢測出乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸和檸檬酸等非揮發(fā)性有機(jī)酸[12]。與之相似，本研究在6 種郫縣豆瓣樣品中也檢測到一定量的乳酸、酒石酸和琥珀酸，并且同其他醬制品不同，在郫縣豆瓣中檢測出了富馬酸，但沒有檢測到丙二酸和戊二酸，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵環(huán)境的不同以及產(chǎn)品類型的差別導(dǎo)致其中有機(jī)酸種類的不同[29]。

表5 郫縣豆瓣樣品中有機(jī)酸含量分析Table 5 Analysis of organic acid contents in commercial samples by HPLC mg/g

3 結(jié) 論

利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化郫縣豆瓣中重要呈味物質(zhì)有機(jī)酸的提取工藝，建立多元二次優(yōu)化模型，并對郫縣豆瓣中有機(jī)酸進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)對有機(jī)酸提取量影響最大，結(jié)合實(shí)際操作，最終確定有機(jī)酸提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、料液比1∶21（g/mL）、超聲時間37 min，實(shí)際值與預(yù)測值相符，該方案準(zhǔn)確可行。

另外通過HPLC法定性及定量分析郫縣豆瓣中呈味有機(jī)酸，6 種郫縣豆瓣中，檢測到有機(jī)酸7 種，分別為草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸和富馬酸，其中檸檬酸含量最高，其次為蘋果酸和乳酸。該結(jié)論可為郫縣豆瓣中特征呈味酸進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，同時為郫縣豆瓣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步完善及風(fēng)味優(yōu)化提供數(shù)據(jù)參考。研究發(fā)酵制品中常見的呈味有機(jī)酸并進(jìn)行定性及定量分析，還可以通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、紅外、核磁等分析手段結(jié)合，鑒定郫縣豆瓣中是否存在特征呈味有機(jī)酸。