響應面法優化郫縣豆瓣中有機酸的提取工藝及HPLC 定量分析

于筱雨，方佳興，向 琴，車振明，劉 平，林洪斌,2,*

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.四川大學輕紡與食品學院，四川 成都 610065）

郫縣豆瓣作為“川菜之魂”，其制作工藝被列為第二批國家級非物質文化遺產名錄[1-2]。郫縣豆瓣由紅辣椒（二荊條）、蠶豆、小麥粉和鹽，經傳統工藝發酵而成，色澤紅潤且醬香味十足，是川菜中最重要的調味料[3-5]。盡管郫縣豆瓣具有悠久的歷史和較高的知名度，深受大眾喜愛，但在國際市場上的競爭力仍無法與日本、韓國、美國等發達國家的發酵調味品相媲美[2]，主要因為郫縣豆瓣傳統生產模式，導致產品質量穩定性差及產品質量標準不完善等。由于地域限制，國外對郫縣豆瓣的研究幾乎沒有，國內對郫縣豆瓣的研究主要集中在香氣成分分析[6]及后發酵期真菌細菌的演替變化分析[7-8]。郫縣豆瓣醬在日曬夜露的陳釀過程中，通過酶促和非酶促作用，形成了其獨特的風味體系，且隨著陳釀時間的延長，酯類組分含量先增后減[9]。郫縣豆瓣中主要香氣化合物的鑒定有助于衡量豆瓣產品風味品質的優劣和劃分產品的質量等級，同時促進郫縣豆瓣生產企業更有效地控制和優化產品的風味品質[10]。想要得到完善的產品質量標準體系，需要綜合考慮呈香呈味物質，因此本實驗立足于此，研究郫縣豆瓣中呈味有機酸的種類及含量。

有機酸主要在發酵過程中，由大分子物質水解以及微生物作用產生，為發酵食品提供獨特的風味[11]，因此是發酵食品一大重要研究方向。Choi等[12]研究不同原料的韓國醬油中有機酸含量的變化；Park等[13]研究大豆醬中有機酸的種類及含量。然而鮮見關于郫縣豆瓣中有機酸的研究，因此有機酸的定性定量分析在郫縣豆瓣呈味研究中具有重要意義。測定有機酸常用方法有滴定法、毛細管電泳法、氣相色譜-質譜法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）以及高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）法[14]。本研究針對郫縣豆瓣中呈味有機酸，采取響應面法優化其提取工藝，并通過準確度高且易操作的HPLC法分析呈味有機酸種類及含量。有機酸作為郫縣豆瓣中一種重要的呈味物質，是重要的產品屬性之一，因此，定性及定量分析郫縣豆瓣中含有的呈味有機酸，為系統研究郫縣豆瓣呈味及風味優化研究奠定基礎，也為制定更加完善的產品質量標準提供數據支撐，對郫縣豆瓣產業健康發展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 種市售不同品牌（丹丹、鵑城、川老匯、川驕、川郫、旺豐）的一級郫縣豆瓣，置于4 ℃保存。

草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、富馬酸、乳酸標準品（純度≥99.5%），氫氧化鈉、乙醇成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

KH3200E超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；TDZ5-WS離心機 上海盧湘儀器有限公司；BSA224S分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；pHS-3C酸度計 成都市世紀方舟科技有限公司；MVS-1旋渦混合器 北京金紫光科技發展有限公司；e-2695 HPLC系統 日本Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 乙醇溶液浸提有機酸的技術路線

郫縣豆瓣樣品→研磨→加溶劑旋渦振蕩→超聲浸提→離心→洗滌沉淀2 次→定容→待測液

1.3.2 有機酸提取量的確定

用移液管吸取待測液20 mL于50 mL燒杯中，用已標定的NaOH溶液進行滴定。滴定至pH計示數為8.2，記錄NaOH滴定液用量，根據消耗的標定NaOH溶液量求出樣品中可滴定酸的含量[15]。計算公式如下：

式中：NaOH當量濃度為0.101 3 mol/L；以檸檬酸作為其換算系數即0.064。

1.3.3 有機酸提取工藝優化

根據相關文獻[16-18]有機酸提取工藝優化，選擇乙醇體積分數、料液比、超聲時間3 個對郫縣豆瓣中有機酸提取量有較大影響的因素進行單因素試驗，在單因素試驗結果的基礎上，采用中心組合設計響應面試驗優化有機酸提取工藝。

1.3.3.1 單因素試驗

研究乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL））、超聲時間（15、30、45、60 min）對郫縣豆瓣中有機酸提取量的影響。

取5.0 g郫縣豆瓣充分研磨置于燒杯中，分別用一定體積分數一定比例的乙醇，旋渦振蕩1 min，室溫超聲提取一定時間，3 500 r/min離心10 min，上清液收集于50 mL容量瓶中，分別用15、10 mL相對應的乙醇溶液2次洗滌沉淀，離心，將上清液合并于容量瓶中，定容得到待測液。

1.3.3.2 響應面試驗

根據單因素試驗結果進一步優化范圍，參考響應面分析因素與水平（表1），進行響應面試驗。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used for response surface analysis

1.3.4 有機酸定性及定量分析[19-20]

標準溶液的制備：分別配制單一標品及混合標品。配制草酸、琥珀酸、富馬酸和乳酸標品質量濃度為0.5 g/L；配制酒石酸和蘋果酸標品質量濃度為1 g/L；配制檸檬酸標品質量濃度為2 g/L。然后配制與之相同質量濃度的混合標品。

樣品的制備：取待測液5 mL，過強陰離子（SAX）小柱（預先用3 mL甲醇，3 mL去離子水活化），控制流速1～2 mL/min，棄去流出液。用5 mL蒸餾水淋洗凈化柱，再用5 mL 20%鹽酸溶液以不超過1 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液5 mL過0.22 μm微孔濾膜后，供HPLC分析。

色譜條件：色譜柱Aminex HPX-87H Ion Exclusion column（300 mm×7.8 mm，3 μm）；柱溫60 ℃；流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液；流速0.5 mL/min；采用光電二極管陣列檢測器；檢測波長210 nm。

1.4 數據處理與統計

采用Design-Expert v8.0.6軟件進行響應面中心組合試驗設計，采用SPSS 17.0軟件對數據進行整理統計分析，各項指標結果以 ±s表示，采用S-N-K法進行差異顯著性分析（P＜0.05），采用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對有機酸提取量的影響

圖1 乙醇體積分數對有機酸提取量的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on extraction of organic acids

由圖1可知，有機酸提取量隨乙醇體積分數增加呈增加趨勢，但增加程度越來越小。有機酸多溶于水或乙醇，隨著乙醇含量的增加，會使一些脂溶性的色素或者親脂性強的成分溶出量增加，這些成分會與乙醇-水分子結合，使得有機酸溶出率受到阻礙，同時考慮到乙醇成本，最終選定60%～80%乙醇體積分數作為進一步優化的范圍。

2.1.2 料液比對有機酸提取量的影響

圖2 料液比對有機酸提取量的影響Fig. 2 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction of organic acids

由圖2可知，有機酸提取量隨提取試劑用量的增加，呈現先增加后減少的趨勢。一般來說，隨著溶劑的增多，提取率也會增加，但當增加到一定量時，溶劑趨于飽和，此時再增加溶劑用量，不會增加有機酸的提取，反而可能使其他水溶性物質溶出增加，阻礙有機酸與乙醇-水的結合。因此考慮有機酸提取率，選擇1∶15～1∶25（g/mL）料液比作為進一步優化的范圍。

2.1.3 超聲時間對有機酸提取量的影響

圖3 超聲時間對有機酸提取量的影響Fig. 3 Effect of ultrasonication time on extraction of organic acids

由圖3可知，隨超聲時間的延長，有機酸提取量呈現先增加后減少的趨勢。超聲有助于有機酸的提取，所以一定程度上，超聲時間越長，有機酸提取量越大，在超聲時間為30 min時有機酸提取量達到最大，超過30 min后，提取量隨時間延長而減小，可能因為長時間超聲處理使得揮發性有機酸含量減少，此外，超聲時間過長，能源消耗過大。綜上，選擇超聲時間20～40 min作為進一步優化的范圍。

2.2 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果選定因素與水平，以有機酸提取量為響應值，采用中心組合設計響應面試驗優化有機酸提取工藝，設計與結果見表2。

表2 有機酸提取的響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3 模型的建立及方差分析

對表2中的試驗數據進行多元二次多項式回歸擬合，得到的三元二次回歸方程為：Y=7.294×10－3＋1.538×10－4A＋1.125×10－5B＋1.075×10－4C＋4.500×10－5AB－5.750×10－5AC＋3.750×10－5BC－3.045×10－4A2－1.695×10－4B2－7.200×10－5C2。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for regression equation

由表3可知，模型P值為0.0147，該模型顯著，表明回歸模型達到顯著水平[21]。失擬項不顯著，相關系數R2值為0.4466，說明該模型與實際情況接近，即試驗誤差小[22]，能充分反映出各因素之間的關系，因此，可用該方程對試驗結果進行分析。由方差分析可知，因素A2影響極顯著（P＜0.01），A、BC、B2影響顯著（P＜0.05），模型中二次項系數均為負數，表明該模型拋物面開口向下，有極大值點，也就是有機酸最優提取點。

圖4 各因素交互作用對有機酸提取量影響的響應面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variable variables on organic acid extraction

各因素顯著程度依次為乙醇體積分數＞料液比＞超聲時間，通過優化分析，最佳的提取條件為乙醇體積分數71.96%、料液比1∶20.68（g/mL）、超聲時間37.04 min，預測有機酸提取量可達到14.7 mg/g，考慮到實際操作的局限性，將提取工藝條件優化為乙醇體積分數72%、料液比1∶21（g/mL）、超聲時間37 min，在此條件下，重復實驗5 次，郫縣豆瓣醬中有機酸提取量為14.58 mg/g，與預測值基本符合，證實該方程的準確性和實用性[23]。

2.4 有機酸定性及定量分析

圖5 7 種有機酸標準品和2 種樣品HPLC圖Fig. 5 HPLC chromatograms of mixed standard solution of 7 organic acids and two samples

表4 有機酸保留時間及響應值Table 4 Retention times and regression equations for organic acids

由圖5和表4可知，草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸和富馬酸的保留時間分別為7.8、9.4、10.0、11.2、13.3、14.9 min和15.7 min。有機酸作為郫縣豆瓣中呈酸味的主要呈味物質，在6 種樣品中測得總有機酸含量分別為11.3（丹丹）、12.355（鵑城）、10.869（川老匯）、9.661（川驕）、9.278 mg/g（川郫）和12.031 mg/g（旺豐）。根據已有研究發現，發酵環境、微生物群體和原料大豆的來源都會對產品的有機酸種類與含量有重要影響[24]。如表5所示，6 種郫縣豆瓣樣品中檸檬酸含量最高，含量分別為4.828 3（丹丹）、6.3（鵑城）、5.134 2（川老匯）、4.197 8（川郫）、5.252 3 mg/g（川驕）和4.364 5 mg/g（旺豐），這個結果與Park等[13]在發酵醬制品中實驗結果相似。郫縣豆瓣中檸檬酸可能由于曲霉的作用，有報道使用同位素標記方法證明曲霉可以誘導某些酶和一些代謝途徑合成檸檬酸[25-27]。蘋果酸和草酸含量排在第2和第3，6 種樣品中蘋果酸含量在2.1～3.6 mg/g之間，草酸含量在1.7～2.4 mg/g之間。蘋果酸可能來自于郫縣豆瓣醬在發酵過程中，酶與糖發生復雜反應產生蘋果酸[28]。韓國大豆醬中檢測出乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸和檸檬酸等非揮發性有機酸[12]。與之相似，本研究在6 種郫縣豆瓣樣品中也檢測到一定量的乳酸、酒石酸和琥珀酸，并且同其他醬制品不同，在郫縣豆瓣中檢測出了富馬酸，但沒有檢測到丙二酸和戊二酸，這可能是因為發酵環境的不同以及產品類型的差別導致其中有機酸種類的不同[29]。

表5 郫縣豆瓣樣品中有機酸含量分析Table 5 Analysis of organic acid contents in commercial samples by HPLC mg/g

3 結 論

利用響應面試驗設計優化郫縣豆瓣中重要呈味物質有機酸的提取工藝，建立多元二次優化模型，并對郫縣豆瓣中有機酸進行定性定量分析。結果顯示，乙醇體積分數對有機酸提取量影響最大，結合實際操作，最終確定有機酸提取工藝條件為乙醇體積分數72%、料液比1∶21（g/mL）、超聲時間37 min，實際值與預測值相符，該方案準確可行。

另外通過HPLC法定性及定量分析郫縣豆瓣中呈味有機酸，6 種郫縣豆瓣中，檢測到有機酸7 種，分別為草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸和富馬酸，其中檸檬酸含量最高，其次為蘋果酸和乳酸。該結論可為郫縣豆瓣中特征呈味酸進一步研究提供數據基礎，同時為郫縣豆瓣質量標準的進一步完善及風味優化提供數據參考。研究發酵制品中常見的呈味有機酸并進行定性及定量分析，還可以通過高效液相色譜-質譜聯用、紅外、核磁等分析手段結合，鑒定郫縣豆瓣中是否存在特征呈味有機酸。