共聚焦顯微鏡在真菌性角膜炎診治中的臨床應用

藍倩倩，陳 琦，陳麗妃，沈朝蘭，黃 慧，曾思明

作者單位:(530021)中國廣西壯族自治區南寧市，廣西壯族自治區人民醫院眼科

0 引言

在我國，真菌性角膜炎患病率占感染性角膜炎的51%～70%［1－2］，如未及時診治易導致角膜穿孔、眼內炎等嚴重后果，早期、快速、明確的診斷有利于準確地治療。真菌性角膜炎的常見實驗室病原學檢查有角膜刮片后涂片在顯微鏡下檢查和真菌培養，涂片簡單、快速，能粗篩病原體，培養則是金標準，但角膜病灶取材量少，陽性率往往不高，而共聚焦顯微鏡可以在細胞水平上對角膜進行非侵犯性、動態、活體的觀察［3－4］。近年來，在檢查真菌性角膜炎的病原、病灶的范圍深度、疾病的發展階段和治療效果等方面取得了一定的研究成果［5－6］。本研究旨在比較共聚焦顯微鏡和角膜刮片的實驗室檢查在診斷真菌性角膜炎中的陽性率，以及兩種方法互相補充的臨床應用。

1 對象和方法

1.1 對象 回顧2015－02/2017－10在我院眼科就診的真菌性角膜炎患者56例56眼，其中男31眼，女25眼，年齡42～83(平均 64.48±13.34)歲。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。真菌性角膜炎的診斷標準:結合病史及癥狀體征，并符合以下4項中的1項:(1)角膜刮片涂片在光學顯微鏡下發現菌絲或孢子;(2)真菌培養陽性;(3)共聚焦顯微鏡檢查見真菌菌絲或孢子;(4)具有典型的真菌性角膜炎的臨床表現，且抗真菌藥物治療有效。排除標準:初診時合并角膜開放性傷口無法接受共聚焦顯微鏡檢查者，實驗室檢查有細菌感染或棘阿米巴感染者，共聚焦顯微鏡檢查發現有明確棘阿米巴原蟲者，不遵醫囑治療或隨訪者，患者因藥物過敏或肝腎功能不全等原因無法接受藥物治療者。

表1 我院初診時的各組病史特點

表2 各治療方案和預后統計

1.2 方法

1.2.1 初診時診療步驟

1.2.1.1 臨床表現 詳細詢問病史，用裂隙燈顯微鏡檢查并拍攝眼前段相片，記錄病灶浸潤面積、位置、深度以及內皮、前房積膿情況等。

1.2.1.2 共聚焦顯微鏡檢查 由具有2a以上共聚焦顯微鏡檢查經驗的眼科醫師操作。操作步驟:患眼滴用鹽酸奧布卡因滴眼液進行表面麻醉后，將氧氟沙星眼膏滴于物鏡頭表面，囑患者注視固視燈，調整物鏡位置使激光光束位于病變區，前移物鏡頭與角膜輕微接觸，掃描角膜各層見真菌菌絲或孢子記為“共焦(+)”，真菌菌絲和孢子均未檢出記為“共焦(－)”。

1.2.1.3 角膜刮片實驗室病原學檢查 患眼滴用鹽酸奧布卡因滴眼液進行表面麻醉，患者取平臥位，采用一次性手術圓頭刀片對角膜病灶進行刮片，涂于載玻片上和血培養皿、馬鈴薯培養皿中，送至醫院檢驗科進行顯微鏡下涂片檢查和培養及藥敏試驗。涂片或培養檢出真菌者可記錄為“病原(+)”，涂片和培養均未檢出真菌者記錄為“病原(－)”。

1.2.2 治療方法

1.2.2.1 藥物治療 就診當天立刻啟動抗真菌治療，有藥敏結果者依據藥敏結果選擇，無藥敏結果根據經驗選擇藥物，局部或聯合全身用藥，每個患者根據病情嚴重程度和進展階段、自身情況選擇不同的藥物種類及用法用量，每次隨訪根據病情判斷藥物治療效果并調整用藥，用共聚焦顯微鏡監測病情變化，感染控制后逐步停藥。

1.2.2.2 手術治療 如藥物治療仍無法控制感染，則采用藥物聯合手術治療，根據病情選擇不同手術方式，如結膜瓣遮蓋術、角膜移植術、眼球摘除術等。術中感染角膜組織送實驗室行病原學檢查。

1.2.3 隨訪 根據每例患者病情嚴重程度決定隨訪頻率，至感染控制停藥后再隨訪3mo，每次隨訪時行裂隙燈眼前段照相和共聚焦顯微鏡檢查。記錄治療方案和預后:單純藥物治療臨床治愈、藥物聯合手術治療臨床治愈。如為藥物聯合手術治療，記錄其具體手術方式，是否為眼球摘除術，并記錄術后感染是否得到控制。

1.2.4 臨床治愈標準 患者自覺畏光、疼痛、流淚等癥狀消失，結膜無充血，角膜上皮愈合，熒光素無染色，角膜浸潤灶消失，基質無水腫，內皮無Kp，前房反應和積膿消失，角膜遺留不同程度的斑翳，共聚焦顯微鏡未見炎癥和病原表現;停藥后隨訪3mo仍未見復發。

統計學分析:用SPSS 19.0軟件包進行統計學分析，計數資料以眼(%)表示，組間比較行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

所有患者入院時，共聚焦顯微鏡診斷陽性者51眼(91%)，角膜刮片病原學檢測診斷陽性者30眼(54%)，差異有統計學意義(χ2=19.670，P＜0.05)，共聚焦顯微鏡和角膜刮片兩者任意之一為(+)者53眼，兩者聯合診斷陽性率為95%。根據共聚焦顯微鏡和角膜刮片檢查的結果分為四組，分別為“病原(+)共焦(+)”，“病原(－)共焦(+)”、“病原(+)共焦(－)”、“病原(－)共焦(－)”，各組至我院初診時的病史特點見表1。所有患者中，單純藥物治療達到臨床治愈者44眼(79%)，單純藥物治療無法控制感染需要進行手術治療者12眼(21%)，其中接受結膜瓣遮蓋術者7眼(13%)，接受角膜移植術者3眼(5%)，接受結膜瓣遮蓋術或角膜移植術的患者均達到臨床治愈標準;另外2眼(4%)因感染嚴重接受眼球摘除術，所有患者術后感染得到控制，各組治療方法和預后見表2。

3 討論

共聚焦顯微鏡的準確診斷依賴于檢查者豐富的經驗和技術水準，在真菌性角膜炎中，共聚焦顯微鏡可觀察到典型的真菌菌絲和孢子［7－8］。謝立信等［9］對 32 例確診為真菌性角膜炎的患者行共聚焦顯微鏡，其中有31例可見真菌，共聚焦顯微鏡確診率為96.9%。美國眼科學會于2004年分析了51項相關研究表明，共聚焦顯微鏡是真菌性角膜炎的重要輔助診斷工具，其中一篇研究中提到共聚焦顯微鏡對真菌有96.6%的檢出率［10］。2007年 Kanavi等［11］對16例真菌性角膜炎患者進行共聚焦顯微鏡檢查，靈敏性為94%，特異性為78%，而用于評價結果的角膜涂片和真菌培養雖是診斷的金標準，卻不具有100%的特異性和靈敏性，因此存在不可忽視的假陽性和假陰性率。2011年Vaddavalli等［12］對實驗室病原學檢查確診的棘阿米巴或真菌性角膜炎患者103例行共聚焦顯微鏡檢查，其敏感性為 88.3%，特異性為 91.1%。Kheirkha 等［13］研究中，有經驗的檢查者用共聚焦顯微鏡在絲狀真菌角膜炎中診斷的敏感性和特異性為(71.4±0)%和(89.6±3.0)%。張紅敏等［14］研究揭示，93例真菌性角膜炎中共聚焦顯微鏡檢查診斷陽性率為82.07%，真菌培養診斷陽性率為43.20%。李昂等［15］研究表明，抗真菌治療后共聚焦顯微鏡診斷陽性率有所下降，降低到59%。

本研究中，對臨床診斷為真菌性角膜炎患者，共聚焦顯微鏡診斷陽性率為91%，角膜刮片病原學檢測診斷陽性率為54%，兩者聯合診斷陽性率上升為95%。聚焦顯微鏡診斷陽性率遠大于角膜刮片病原學檢測，是一種快捷、有效的診斷手段，而兩種檢查方法聯合應用可以更進一步提高診斷的陽性率。

我院初診時，發病時間長、在外院使用過抗真菌藥或外院行角膜刮片檢查均會影響共聚焦顯微鏡和病原學檢查的陽性率。因為這類患者病情往往比較嚴重，可能已經輾轉過幾家醫院，在外院治療效果不佳才轉至我院進一步診治，加上多種藥物毒性等因素混雜，導致初診時裂隙燈下臨床表現不典型，輔助檢查陽性率不高。

本研究中，角膜刮片病原學檢查陽性而共聚焦顯微鏡陰性的2眼患者中，有1眼我院首診時已有近1mo的病程，角膜水腫明顯，潰瘍表面壞死組織過多，角膜內皮和前房可見團塊狀病灶，共聚焦顯微鏡光線穿透力有限，未能穿透混濁的壞死組織探查到角膜深層和內皮面的病原體;另1眼角膜刮片見孢子未見菌絲，提示為酵母菌感染，當孢子形態不典型、量少及炎癥細胞量多時，共聚焦顯微鏡對酵母菌的診斷難度提高，需要依賴檢查者豐富的經驗。此外，Shah 等［16］和 Sagoo等［17］分別報道了微孢子真菌性角膜炎，微孢子的大小約1～2μm，共聚焦顯微鏡不容易被分辨出，因此漏診率高。有3眼患者檢查“病原(－)共焦(－)”，但抗真菌治療有效，臨床診斷為真菌性角膜炎。其中1眼是在外院接受的角膜刮片，可能是角膜刮片導致菌絲遭到破壞、斷裂致形態不典型和數量減少，影響了共聚焦顯微鏡對病原體形態的觀察，此提示在臨床上應先行共聚焦顯微鏡檢查再行角膜刮片檢查，以免影響共聚焦顯微鏡對病原體的觀察;第2眼是在外院已經接受過抗真菌治療，推測病原體得到一定程度的控制，因此實驗室檢查和共聚焦顯微鏡都是陰性;第3眼有植物外傷史，角膜有微小穿通傷，雖就診時傷口已閉合，但真菌除了感染角膜還透過角膜傷口穿透到前房，引起眼內炎，行眼球摘除后在眼球組織里培養到真菌，由于病灶主要聚集在角膜深基質層、角膜內皮面，術前角膜淺基質層刮片未找到病原體，角膜基質的水腫和傷口周圍的壞死組織也影響了共聚焦顯微鏡光線的穿透力。

本研究對藥物治療無法有效控制感染的患者行手術治療，手術方式有結膜瓣遮蓋術、羊膜移植術、角膜移植術、眼球摘除術，所有患者在手術后感染得到了控制，未見真菌感染蔓延至眼眶組織及全身，其中有2眼接受了破壞性的眼球摘除術，1眼初診時發病25d，在外院有激素使用史，我院檢查“共焦(+)病原(+)”，初診時病情重，全角膜感染合并眼內炎，考慮真菌直接穿透角膜進入眼內引起眼內炎;另1眼初診時“共焦(－)病原(－)”。

角膜刮片的實驗室病原檢查方法是傳統的檢查方法，可以準確地檢出病原體并且能去除部分病原和組織壞死物，顯微鏡下涂片檢查是快速而便捷的方法，培養則是金標準，但受取材限制陽性率低，而且培養的時間長，不利于及時地診治，做為侵犯性檢查手段也不適合反復檢查以監測病情變化。共聚焦顯微鏡在活體水平快速無創地探查真菌病原體，以早期確診啟動抗真菌藥物治療，此外還能準確地探查病灶的深度，客觀評估預后，另可方便無創地動態監測病情變化，可監測角膜中菌絲的數量、密度和深度變化。本研究中，根據共聚焦顯微鏡判斷病情嚴重程度和病情變化趨勢，為治療方案的制定和調整、藥物使用的種類和頻率、手術方式和時機的選擇、停藥的時機提供了客觀有利的依據。但共聚焦顯微鏡檢查也有其局限性，例如依賴檢查者的技能水準不易普及至基層醫院;對被檢查者的配合程度要求較高;難以始終檢測同一區域，不利于精確對比不同時間點的細微變化;角膜的透明性會影響激光穿透力;對于一些不典型的圖形特征的不恰當解讀會造成一定的假陰性率和假陽性率等。

共聚焦顯微鏡和角膜刮片的實驗室檢查各有優缺點，但聯合使用可以互相補充，我們建議每個臨床擬診為真菌性角膜炎患者在首診時啟動藥物治療之前，都應該同時采用兩種方法聯合檢查，以提高病原學檢查的陽性率，提高診斷的準確性，更好地指導治療，而在隨訪過程中，則可以使用共聚焦顯微鏡監測病情變化。共聚焦顯微鏡雖然還不能替代真菌培養成為診斷的金標準，但是其高敏感性、無創性、可重復性、快捷性為真菌性角膜炎等臨床診斷及治療提供了有利工具，具有廣闊的應用前景。