5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑及甘氨酸根銅Ⅱ配合物的合成、DNA結(jié)合及抗癌活性

莫慧雯 劉雅嫻 蔡戴宏 沈 芳 樂學(xué)義

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，廣州 510642)

銅是人體內(nèi)必需的生命元素，作為結(jié)構(gòu)和催化輔助因子參與機(jī)體內(nèi)許多生命過程，并且其配合物在氧化還原環(huán)境中有著可調(diào)控的配位構(gòu)型，在細(xì)胞水平能得到更好的利用，因此常常作為藥物分子尤其是抗腫瘤藥物分子的基本結(jié)構(gòu)單元[1-2]。芳雜環(huán)化合物具有生物分子中咪唑、嘌呤堿和嘧啶堿等基團(tuán)類似的配位性質(zhì)，并且具有潛在的殺菌、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤等生物活性，尤其是當(dāng)與生命元素形成配合物時(shí)通過協(xié)同作用可進(jìn)一步提高其生物活性[3-4]。氨基酸為重要的生物配體，具有很好的生物兼容性和潛在的生物活性(如抗氧化、抗腫瘤等)及識別生物大分子的功能，作為配體不僅有助于提高配合物的生物活性，而且能夠改善配合物在溶液中的溶解性，提高其生物利用率，降低其毒副作用等[5-6]。

基于以上考慮，本研究設(shè)計(jì)、合成和表征了新的三元銅Ⅱ混配配合物[Cu(HPBM)(Gly)(H2O)]ClO4·0.5H2O(其中 HPBM=5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑，Gly=甘氨酸根)。研究了配合物與DNA的作用及其抗腫瘤活性，探討了其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料和儀器

小牛胸腺DNA(CT-DNA)購自華銳試劑有限公司，生物純；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)所用試劑或試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，生物純；其它試劑均為市售分析純；食管癌細(xì)胞(Eca-109)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和人肺癌細(xì)胞(A549)等細(xì)胞系來自于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。整個(gè)試驗(yàn)過程使用的水均為去離子水。

所用儀器有：河南鞏義儀器有限公司DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀；美國Nicolet公司ACATAR 360 FTIR型紅外光譜儀；德國ELEMENTAR公司Vario EL元素分析儀；日本Shimadzu公司Pharmacia UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)；日本島津RF-5301熒光光譜儀；上海晶菱玻璃有限公司烏氏粘度計(jì)；瑞士Tecan公司Infinite M200 pro多功能酶標(biāo)儀；北京六一儀器廠JY200C電泳儀；意大利Laboratories-Segrate BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)；美國Thermo公司Scientific Forma CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；德國LEICA公司DMI3000B正置熒光顯微鏡；美國BD Bioscience公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀。

1.2 常用溶液的配制

Tris-HCl/NaCl緩沖溶液(pH=7.2)：0.005 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷(Tris)+0.05 mol·L-1NaCl。0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)：2.68 mmol·L-1KCl+0.138 mol·L-1NaCl+1.76 mmol·L-1KH2PO4+0.01014 mol·L-1Na2HPO4。0.012 mol·L-1噻唑藍(lán)(MTT)溶液：用 0.01 mol·L-1PBS配制。配好后置于4℃下避光保存，儲存時(shí)間不超過1周。CT-DNA溶液：用Tris-HCl/NaCl緩沖溶液配制。配制好后測得A260/A280比值介于1.8～1.9之間，表明溶液中基本不含蛋白質(zhì)， 且濃度以 ε260=6 600 L·mol-1·cm-1確定[7]。 CTDNA溶液放置在4℃冰箱內(nèi)保存，且儲存時(shí)間不超過3 d。

1.3 配合物的合成

首先，參照文獻(xiàn)方法[8]制備配體HPBM。

配合物合成具體過程如下：稱取HPBM(0.5 mmol，0.052 3 g)于20 mL無水甲醇中，待其完全溶解后加入1 mL 0.5 mol·L-1Cu(ClO4)2溶液，加熱攪拌得到草綠色澄清液A；然后稱取甘氨酸(0.5 mmol，0.0188 g)溶于4 mL去離子水中，再加入1 mL的0.5 mol·L-1NaOH溶液，得到B液；將B液緩慢滴加到A液中，加熱攪拌回流1 h后自然冷卻到室溫，過濾、靜置自然揮發(fā)，2周后得到墨綠色粉末態(tài)沉淀物。將過濾得到的固體粉末用甲醇重結(jié)晶，獲得的固體產(chǎn)物空氣干燥后密封保存。元素分析按CuC15H18N4O7.5Cl 計(jì) 算 值 (%)：C，38.07；H，3.80；N，11.84。實(shí)驗(yàn)值(%)：C,37.86；H，3.86；N，11.72；IR(KBr，cm-1)：3 438(s，br)，3 311(w)，3 149(w)，1 612(s)，1 492(s)，1 398(s)，625(w)，432(w)；UV-Vis(甲 醇 為 溶 劑 )，λ/nm(ε/(L·mol-1·cm-1))：207(46 512)，348(21 262)，626(65.35)；MS(甲 醇為 溶 劑)：m/z=345.9 對 應(yīng) 于[Cu(HPBM)(Gly)]+； 電導(dǎo)率測定(甲醇為溶劑)：Λ=104.2 S·cm2·mol-1。

1.4 配合物與DNA相互作用實(shí)驗(yàn)

1.4.1 電子吸收光譜滴定實(shí)驗(yàn)

在空白池和樣品池中分別加入3 mL Tris-HCl/NaCl緩沖溶液和50 μmol·L-1配合物溶液， 用紫外分光光度儀檢測在200～450 nm波長范圍內(nèi)電子吸收光譜，隨后依次往空白池和樣品池中分別加入等體積的2 mmol·L-1CT-DNA溶液，使CT-DNA與配合物的濃度比值不斷增加。每次加入CT-DNA溶液并靜置5 min后，在上述同樣波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.4.2 熒光猝滅光譜測定

將等體積(2.5 mL)的 8 μmol·L-1溴化乙啶(EB)與10 μmol·L-1CT-DNA溶液混勻，放置2 h使 EB與CT-DNA充分作用。往樣品池中加入3 mL的EB-CT-DNA混合溶液，設(shè)定好相關(guān)參數(shù)值：激發(fā)波長為525 nm，掃描速度為240 nm·s-1，掃描波長范圍540～700 nm。然后，用移液槍依次往EB-CT-DNA體系中滴加1 mmol·L-1配合物溶液20 μL，使配合物濃度不斷增加。每次待其反應(yīng)5 min后測定其熒光發(fā)射光譜。

1.4.3 粘度測定

粘度測定試驗(yàn)參照我們以前報(bào)道的方法進(jìn)行[9]。

1.4.4 分子對接

使用Gaussian viewer軟件畫出配合物的分子結(jié)構(gòu)，并采用Gaussian 09軟件進(jìn)行幾何構(gòu)型優(yōu)化，優(yōu)化后得到的配合物分子結(jié)構(gòu)文件用于分子對接。DNA結(jié)構(gòu)文件來自PDB數(shù)據(jù)庫(PDB ID：6BNA)。整個(gè)分子對接過程在AutoDock4.2軟件[10]上進(jìn)行，格點(diǎn)間隔為0.037 5 nm，格點(diǎn)中心坐標(biāo)為：x=24.986、y=9.578、z=20.079，格點(diǎn)大小為 60×60×60，采用經(jīng)典拉馬克遺傳算法 (Lamarckian genetic algorithm，LGA)，計(jì)算輪數(shù)為100，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。配合物分子和DNA分子間的能量匹配用半經(jīng)驗(yàn)的自由能計(jì)算方法進(jìn)行評價(jià)[11]。計(jì)算結(jié)果使用Autodock 1.5.6軟件進(jìn)行分析并運(yùn)用PyMol軟件進(jìn)行可視化處理[12]。

1.5 配合物細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1.5.1 MTT實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)細(xì)胞用RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，復(fù)蘇后的細(xì)胞接種于50 cm3培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為每孔8×103～1×104個(gè)之間，將該板放置于含 5%(V/V)CO2的37℃無菌培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁并長至85%時(shí)進(jìn)行加藥處理。每種試驗(yàn)藥物設(shè)置7個(gè)濃度，其濃度變化范圍為 1.57～100 μmol·L-1，每個(gè)樣重復(fù) 3 次，并使用順鉑作為陽性對照。加藥孵育48 h后，除去孔中上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，緩慢振蕩10 min使藍(lán)色甲瓚溶解完全，使用多功能酶標(biāo)儀測定96孔板各孔在490 nm處的吸光度值，記錄并處理分析結(jié)果。

1.5.2 AO/EB雙重?zé)晒馊旧?/p>

將1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)基，然后加入新的RPMI-1640培養(yǎng)基和一定濃度的試驗(yàn)藥物化合物，設(shè)置空白組和加藥組，孵育24 h后除去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，加入吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)混合染色液(100 μg·mL-1AO，100 μg·mL-1EB)染色，置培養(yǎng)箱中避光作用 15 min后，再用PBS清洗掉細(xì)胞表面殘留的染色液，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)并進(jìn)行拍照 (全程盡量避光)。

1.5.3 單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)

將處于對數(shù)期的Eca-109細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約35萬個(gè)細(xì)胞，置于5%(V/V)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，再加藥物化合物并放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)板取出并棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗掉殘余的培養(yǎng)基和細(xì)胞碎片，再加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，待消化完全后加入等量的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，以800 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min后倒掉上清液，然后添加PBS至細(xì)胞懸浮液濃度約為2×105mL-1。

用PBS配制0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(NMA)置于56℃水浴中恒溫備用，同時(shí)用該緩沖液配制0.5%和1.0%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(LMA)置于38℃水浴中恒溫備用。取100 μL 0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠鋪于載玻片上并放上蓋玻片，置于4℃冰箱中冷卻10 min作為第一層膠；去掉蓋玻片，取50 μL上述細(xì)胞懸浮液與50 μL 1.0%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混合均勻后立即鋪于第一層膠上，放上蓋玻片并置于冰箱中冷卻10 min；再取100 μL 0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠鋪于第二層膠上，同樣放上蓋玻片置于冰箱中冷卻10 min，至此制得三層膠板。將制得的膠板放入4℃堿性細(xì)胞裂解液中裂解2 h，緊接著用蒸餾水沖洗掉膠面上的堿性裂解液，再置于電泳槽中電泳20 min(25 V，300 mA)。電泳結(jié)束后，用冰水清洗膠板 10 min，再用 20 μL EB 溶液(20 μg·mL-1)在避光條件下作用20 min，最后用水清洗膠板后上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.5.4 線粒體膜電位變化檢測

以每孔約2×105個(gè)處于對數(shù)期生長的Eca-109細(xì)胞接種于12孔板，置于5%(V/V)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育過夜，待細(xì)胞貼壁并長至80%左右加入相應(yīng)藥物化合物繼續(xù)孵育。作用24 h后，吸棄舊培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，每孔加入1 mg·mL-1熒光探針JC-1，在37℃干燥箱中避光孵育30 min。最后，用PBS清洗并立即上機(jī)檢測，全程盡量避光。

1.5.5 細(xì)胞周期檢測

將每孔約4×105個(gè) Eca-109細(xì)胞接種于 6孔板，置于5%(V/V)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，再加入一定濃度的藥物化合物孵育24 h。棄掉殘余培養(yǎng)液，用PBS清洗2次后加入15 μL 0.2 mg·mL-1核糖核酸酶(RNAse)和 15 μL 0.02 mg·mL-1碘化丙啶(PI)并避光放置30 min，最后使用流式細(xì)胞儀檢測處于各個(gè)期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的表征

在配合物紅外光譜中，3 438 cm-1處強(qiáng)吸收峰歸屬于水的-OH伸縮振動(dòng)；3 311和3 149 cm-1處吸收峰分別歸屬于-NH2的不對稱伸縮振動(dòng)和對稱伸縮振動(dòng)；1 750～1 700 cm-1范圍內(nèi)沒有吸收帶，表明甘氨酸根參與了配位[13]；1 612和1 392 cm-1處吸收峰分別為-COO-的不對稱伸縮振動(dòng)和對稱伸縮振動(dòng)，且 Δν=νas-νs＞200 cm-1，表明甘氨酸根中-COO-為單齒配位基團(tuán)；1 492 cm-1處尖銳的吸收峰可歸屬于芳雜環(huán)配體上的C=N伸縮振動(dòng)；625和432 cm-1處的吸收峰可歸屬于Cu-O和Cu-N的伸縮振動(dòng)[14]。

在配合物甲醇溶液紫外可見光譜中，207和348 nm處2個(gè)較強(qiáng)的吸收峰歸屬于配體的π→π*躍遷，并且與自由配體HPBM相關(guān)吸收峰相比，配合物吸收峰均發(fā)生了紅移 (202→207 nm，317→348 nm)，且吸收強(qiáng)度減弱，證實(shí)了HPBM參與配位；626 nm處弱而寬的吸收峰歸屬于中心離子Cu2+的d→d躍遷,表明配合物分子可能具有變形四方錐結(jié)構(gòu)[15]，即具有5個(gè)配位原子。

配合物元素分析結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)值與理論計(jì)算值一致。而配合物甲醇溶液質(zhì)譜中存在[Cu(HPBM)(Gly)]+離子峰，進(jìn)一步證實(shí)了HPBM及Gly與Cu2+配位。另外，測得配合物在甲醇溶液的摩爾電導(dǎo)率值為104.2 S·cm2·mol-1，表明配合物為 1∶1 型電解質(zhì)[16]，高氯酸根未參與配位。結(jié)合上述配合物紫外可見光譜分析結(jié)果，可推測有一水分子參與配位。

據(jù)上述元素分析、紅外光譜、紫外可見光譜、質(zhì)譜及摩爾電導(dǎo)率等測定結(jié)果，并參照類似配合物[Cu(pbt)(Gly)(H2O)]ClO4[17]研究結(jié)果，可合理地推測標(biāo)題配合物分子式為[Cu(HPBM)(Gly)(H2O)]ClO4·0.5H2O，可能的分子結(jié)構(gòu)如圖所示：

圖1 配合物可能的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Possible molecular structure of the complex

2.2 配合物與DNA的作用

2.2.1 配合物與DNA作用的電子吸收光譜

在研究小分子化合物(配合物)與DNA的作用中，電子吸收光譜是最常用的方法之一。可以通過DNA滴定過程中配合物電子吸收光譜吸收峰的減色或增色、紅移或藍(lán)移等現(xiàn)象初步判斷配合物與DNA的結(jié)合模式。配合物的電子吸收光譜滴定實(shí)驗(yàn)如圖2所示。

圖2 配合物在不同CT-DNA濃度下的電子吸收光譜圖Fig.2 Electronic absorption spectra of the complex upon addition of CT-DNA

結(jié)果表明，隨著CT-DNA濃度增加(圖中箭頭指向)，配合物在342 nm處具有比較弱的減色性，最后趨于穩(wěn)定，且吸收峰位置未出現(xiàn)明顯的移動(dòng)，由此推測配合物對CT-DNA具有部分插入作用且較弱。此外，根據(jù)滴定過程中配合物光譜吸收帶強(qiáng)度的變化，應(yīng)用下列方程式可獲得配合物與CT-DNA的結(jié)合常數(shù)Kb[18]：

式中 cDNA為 CT-DNA 的濃度，εa、εb和 εf分別表示與CT-DNA完全結(jié)合后配合物的摩爾吸光系數(shù)及自由配合物的摩爾吸光系數(shù)。以cDNA/(εf-εa)對cDNA作圖，則斜率與截距的比值為結(jié)合常數(shù)Kb。獲得標(biāo)題配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)為7.26×104L·mol-1，比沒有甲基取代的吡啶基苯并咪唑銅Ⅱ配合物[Cu(HPB)(Gly-L-val)(H2O)]ClO4的結(jié)合常數(shù)(3.21×105L·mol-1)小[19]，這可能主要?dú)w因于HPB環(huán)上引入甲基后產(chǎn)生了空間位阻，不利于配合物插入到DNA堿基對之間。

2.2.2 配合物與DNA作用的熒光猝滅

EB本身沒有熒光性質(zhì)，但當(dāng)插入到DNA堿基對中時(shí)會產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。通過將配合物溶液滴加到DNA-EB體系之后，測定體系熒光強(qiáng)度的變化并獲得配合物的猝滅常數(shù)，進(jìn)而可分析配合物與DNA的作用模式。標(biāo)題配合物對EB-CT-DNA體系熒光猝滅作用如圖3所示。可以看出，隨著配合物濃度增加(圖中箭頭指向)，EB-CT-DNA體系的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，表明配合物分子進(jìn)入堿基對之間將EB擠出來并取代了其位置。另外，據(jù)Stern-Volmer公式[20]可計(jì)算出標(biāo)題配合物對EB-CT-DNA體系的熒光猝滅常數(shù)KSV值：

其中I0和I分別表示未加入和加入配合物時(shí)EBDNA體系的熒光強(qiáng)度，r為配合物與DNA濃度的比值。獲得配合物對EB-CT-DNA體系的熒光猝滅常數(shù)值為0.116 2，表明二者作用較弱，具有部分插入作用，與以上電子吸收光譜法測定結(jié)果一致。

圖3 配合物對EB-CT-DNA體系熒光光譜的影響Fig.3 Effects of the complex on fluorescence spectra of EB-CT-DNA system

2.2.3 配合物與DNA作用的粘度實(shí)驗(yàn)

在缺少晶體學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的情況下,粘度測定被認(rèn)為是檢測配合物與DNA結(jié)合模式最有效的方法[21]。加入配合物時(shí)，若DNA溶液粘度無明顯變化，表明配合物以靜電、溝槽等非插入模式結(jié)合；若DNA溶液粘度降低，表明配合物以部分插入的模式進(jìn)行了結(jié)合；若DNA溶液粘度增大，則說明配合物以經(jīng)典的插入模式結(jié)合。配合物對CT-DNA溶液粘度影響如圖4所示。結(jié)果表明，隨著配合物的加入，起初CT-DNA的粘度下降，但當(dāng)配合物與CT-DNA的比例增加到一定程度(0.05)后粘度基本保持不變，由此推測配合物部分以插入模式作用，而大部分以溝槽結(jié)合方式與CT-DNA作用，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 配合物及EB濃度的增加對CT-DNA相對粘度的影響Fig.4 Effect of increasing amounts of the complex and EB on relative viscosity of CT-DNA

2.2.4 配合物與DNA作用的分子對接

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推斷配合物可能主要以溝槽結(jié)合方式與DNA結(jié)合。為進(jìn)一步驗(yàn)證配合物與DNA之間相互作用的模式，我們使用DNA分子片段6BNA(PDB ID∶6BNA)進(jìn)行了分子對接計(jì)算。得到的最低能量構(gòu)象如圖5所示。結(jié)果表明，配合物-DNA最穩(wěn)定構(gòu)象的結(jié)合能為-36.84 kJ·mol-1，配合物結(jié)合在DNA小溝處，并與鄰近的堿基形成氫鍵(配合物：N4H13…6BNA∶DT-19∶O2(0.259 7 nm)，配合物：N4H13…6BNA∶DT-7∶O2(0.192 8 nm))，結(jié)合模式與上述粘度測量等實(shí)驗(yàn)方法獲得的結(jié)果一致。另外，標(biāo)題配合物與DNA結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力為范德華力，而氫鍵也是維持配合物與DNA復(fù)合物穩(wěn)定性的重要因素。

圖5 配合物與DNA(PDB ID:6BNA)分子對接最優(yōu)構(gòu)象Fig.5 Molecular docked model of the complex with DNA

2.3 配合物的體外細(xì)胞毒性

2.3.1 MTT實(shí)驗(yàn)

以順鉑作為陽性對照，應(yīng)用MTT法測得配合物及配體 HPBM對所選細(xì)胞株 (Eca-109、HeLa和A549)的抑制活性(IC50值)如表1所示。由表1可見，配體HPBM細(xì)胞毒性較弱，但當(dāng)與銅Ⅱ形成標(biāo)題配合物后，其活性顯著增強(qiáng)(提高10～20倍)，并與順鉑相當(dāng)，表明配體與銅Ⅱ的協(xié)同作用對配合物的抗癌活性有重要影響。其中配合物對Eca-109細(xì)胞最為敏感、抑制作用最強(qiáng)，故以下選用Eca-109細(xì)胞對配合物的抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行探究。

表1 配體及配合物對細(xì)胞的IC50值Table 1 IC50values of HPBM and the complex toward selected cell lines

2.3.2 AO/EB染色法

采用AO/EB染色法觀察配合物作用后Eca-109細(xì)胞形態(tài)的變化。其中，AO能分別透過活細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色熒光，而EB僅能在細(xì)胞膜受損時(shí)嵌入DNA呈現(xiàn)紅色熒光。配合物對Eca-109細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡試驗(yàn)如圖6所示。結(jié)果表明，與空白組實(shí)驗(yàn)a的細(xì)胞形態(tài)相比較，在配合物作用實(shí)驗(yàn)b中可觀察到細(xì)胞收縮、細(xì)胞質(zhì)凝結(jié)等現(xiàn)象，表明該配合物的加入能夠誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖6 配合物對Eca-109細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)Fig.6 Apoptosis induction experiment of Eca-109 cells by the complex

2.3.3 單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果分析

DNA作為生命的基礎(chǔ)分子，其碎片化是細(xì)胞凋亡和有絲分裂的重要標(biāo)志之一[22]。藥物作用于細(xì)胞后，通過檢測DNA的變化，可間接反映藥物是否誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)是一種在單細(xì)胞水平上檢測DNA損傷的研究方法，因受損的細(xì)胞核在電場的作用下向正極移動(dòng)，形成類似彗星的尾巴，故又稱彗星實(shí)驗(yàn)。本文用配合物處理Eca-109細(xì)胞24 h后，測得其單細(xì)胞凝膠電泳如圖7所示。從圖中可見，對照試驗(yàn)(a)中的Eca-109細(xì)胞呈球體，而當(dāng)有配合物作用(b、c)時(shí)有彗星拖尾現(xiàn)象，表明配合物的加入使Eca-109細(xì)胞中的DNA碎片化，從而進(jìn)一步證明了標(biāo)題配合物能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。并且發(fā)現(xiàn)，隨著配合物濃度增加(6.25→12.5 μmol·L-1)，彗星尾巴增長(b→c)，表明配合物濃度越高細(xì)胞DNA的損傷越嚴(yán)重。

圖7 配合物與Eca-109細(xì)胞作用的單細(xì)胞凝膠電泳圖Fig.7 Single cell gel electrophoresis of Eca-109 cells treated by the complex

2.3.4 線粒體膜電位檢測結(jié)果分析

圖8 配合物對Eca-109細(xì)胞線粒體膜電位影響的變化圖Fig.8 Changes in the effect of the complex on the mitochondrial membrane potential of Eca-109 cells

文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)線粒體膜電位喪失時(shí)，線粒體會通過釋放促凋亡因子如細(xì)胞色素c和凋亡誘導(dǎo)因子進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。通常JC-1作為熒光探針可應(yīng)用于檢測線粒體膜電位變化，在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中而形成聚合物，將產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1為單體，將產(chǎn)生綠色熒光。因此可通過檢測結(jié)果計(jì)算紅色和綠色熒光的比例,進(jìn)一步分析線粒體膜電位的變化趨勢。配合物對Eca-109細(xì)胞線粒體膜電位的影響如圖8所示。由圖中可見，空白對照中紅色和綠色熒光的比例為4.17，陽性對照(cccp：羰基氰化物間氯苯腙)中熒光比例為2.81，而配合物濃度為6.25和12.5 μmol·L-1時(shí)熒光比例分別為 3.84 和 2.95。結(jié)果表明配合物的加入導(dǎo)致線粒體膜電位喪失，并且配合物濃度越大膜電位喪失越大，從而揭示了標(biāo)題配合物的抗癌活性與細(xì)胞線粒體功能失調(diào)有關(guān)。

2.3.5 細(xì)胞周期結(jié)果分析

已有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)藥物作用后，將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而DNA的合成被阻斷而產(chǎn)生抗腫瘤作用[23]。本文應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定了配合物與Eca-109細(xì)胞作用后細(xì)胞的周期分布情況，如圖9所示。結(jié)果表明，在 6.25 μmol·L-1配合物作用 24 h 后，Eca-109細(xì)胞S期和G2/M期分別由對照實(shí)驗(yàn)時(shí)的32.83%和16.39%增加到36.87%和17.73%，表明標(biāo)題配合物能將Eca-109細(xì)胞阻滯在S期和G2/M期，其中S期增加的細(xì)胞較多 (4.04%)。因此，該配合物能使Eca-109細(xì)胞周期主要阻滯在S期。

圖9 Eca-109細(xì)胞在對照實(shí)驗(yàn) (a)及在6.25 μmol·L-1配合物作用后 (b)的細(xì)胞周期分布圖Fig.9 Cell cycle distribution of Eca-109 cells in the control(a)and exposed to 6.25 μmol·L-1of the complex for 24 h(b)

3 結(jié) 論

合成、表征了新的 5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑的氨基酸銅Ⅱ配合物，并著重研究了配合物與DNA結(jié)合及其抗腫瘤活性。結(jié)果表明，配合物主要通過溝槽結(jié)合方式與DNA作用，對所選癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用(IC50＜10 μmol·L-1)，其中對 Eca-109細(xì)胞活性最強(qiáng)。并且以Eca-109細(xì)胞為研究對象，通過AO/EB雙染法、單細(xì)胞凝膠電泳、線粒體膜電位及細(xì)胞周期測定分析，揭示了配合物通過DNA結(jié)合及線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果對設(shè)計(jì)、合成新的銅Ⅱ配合物抗癌藥物具有一定參考價(jià)值。