2015—2017年中山市某醫院沙門菌的藥敏分析及腸毒素基因檢測

向蓉 陳榮忠 黃雪珍

(南方醫科大學附屬小欖醫院檢驗科，中山 528415)

沙門菌屬是一類重要的人畜共患病原菌，具有分布廣泛、抗原位點復雜及血清型繁多等生物學特征。近年來，由于抗菌藥物的不規范使用，導致沙門菌株耐藥現象日趨嚴重，而食物供應冷鏈技術的快速發展，使非傷寒沙門菌(nontyphoidalSalmonella,NTS)的感染在諸多食源性疾病中與日俱增，已成為全球性關注的公共衛生問題之一[1-2]。本研究通過回顧性分析2015年1月—2017年12月中山市小欖人民醫院住院患者沙門菌的血清分型、藥物敏感試驗和腸毒素基因，為控制中山市西北部區域沙門菌的感染提供流行病學調查依據。

1 資料與方法

一般資料 收集我院2015年1月—2017年12月因發熱、腹瀉等癥狀就診的患者糞便標本4019份，其中經糞便培養證實為沙門菌感染患者為108例，年齡0～72歲，同一患者同一種菌株不計在內。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

VITEK-2全自動微生物分析儀及其配套GN鑒定卡、AST-GN13藥敏卡(法國Bio-Mérieux公司)，凝膠成像儀系統(Bio-rad公司，美國)，2720 Thermal Cycler PCR擴增儀(美國ABI公司)，WD-9403C紫外儀(六一儀器廠，北京)，DYY-2C型電泳儀(六一儀器廠，北京)。

1.2.2 主要試劑

哥倫比亞血平板、麥康凱培養基、XLD培養基、MH瓊脂培養基購自廣州市迪景微生物科技有限公司，抗菌藥敏紙片為英國Oxoid公司，沙門志賀增菌肉湯購自江門市凱林貿易有限公司，沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業有限公司，瓊脂糖購自賽國生物科技，100bp DNA Ladder，細菌基因組DNA提取試劑盒、spvA，spvB，rck引物合成、DNA Mark、Premix溶液(包含Mg2+、Taq酶、dNTPs)等PCR實驗相關試劑均購自達安基因股份有限公司，質控菌株為銅綠假單胞菌(ATCC27853)，大腸埃希菌(ATCC25922)均購自衛生部臨檢中心。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及血清分型

標本的采集、運送及分離培養均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》進行。糞便標本經沙門志賀增菌肉湯增菌后，接種于哥倫比亞血平板、麥康凱培養基及XLD培養基，經35℃培養孵箱培養18～24h，挑取XLD培養基上可疑的黑色菌落，經VITEK-2全自動微生物分析儀進行菌種鑒定。若鑒定結果為沙門菌，則根據K-W血清分型表進行血清學鑒定。

1.3.2 藥敏試驗

采用2017年美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)指南推薦的紙片擴散法和自動化儀器對已分型的沙門菌株進行藥物敏感試驗。由于沙門菌和志賀菌對氨基糖苷類，第一、二代頭孢菌素和頭霉素可能在體外試驗顯示活性，但臨床治療無效，不應報告為敏感。本研究選擇以下10種抗菌藥物：氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢他啶、環丙沙星、哌拉西林/三唑巴坦、復方磺胺甲噁唑和亞胺培南。多重耐藥定義：對3類及以上抗菌藥物耐藥的菌株。本文設定為對氨芐西林、氨曲南、環丙沙星、復方磺胺甲噁唑及第三代頭孢菌素其中3類及以上抗菌藥物耐藥的沙門菌為多重耐藥。

1.3.3 腸毒素基因檢測

根據GenBank公布的關于沙門菌屬的腸毒素基因(spvA,spvB,rck)序列設計PCR反應引物(表1)，嚴格按照細菌DNA提取試劑盒的要求進行DNA的提取。通過PCR方法對3種腸毒素基因進行擴增反應，總反應體系為20μL ，PCR預混合試劑10μL，擴增引物各1.0μL，模板DNA 2μL，滅菌雙蒸水補足20μL； PCR擴增參數：94℃預變性3min，94℃變形30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環，最后72℃延伸5min。采用2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)對擴增產物進行電泳，確定菌株是否含有相應腸毒素基因。

1.4 統計學分析

表1 沙門菌腸毒素基因的PCR擴增引物Tab.1 PCR amplification primer for Salmonella enterotoxin gene

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以率表示，組間比較使用χ2檢驗，P＜0.05為存在統計學差異；應用WHONET 5.6軟件對沙門菌株的藥敏結果進行統計分析。

2 結果

2.1 患者臨床資料調查

2015年1 月—2017年12月共收集糞便標本4019份，檢出沙門菌108株，陽性率為2.69%。男性患者68例，女性患者40例，男女比例為1.7:1。不同年齡段患者構成情況如下：≤1歲(嬰兒)分離出沙門菌50株，占46.30%(50/108)；1～3歲(幼兒)占37.04%(40/108)；3～18歲(兒童)占4.63%(5/108)；≥18歲(成人)占12.04%(13/108)，沙門菌感染以嬰幼兒多見。

全年不同月份均有沙門菌的檢出，其檢出率各不相同(圖1)。1～3月(冬季)沙門菌的檢出率為0.79%(8/1016)；4～6月(春季)的檢出率為2.39%(19/794)；7～9月(夏季)的檢出率為4.32%(47/1089)；10～12月(秋季)的檢出率為3.04%(34/1120)。沙門菌在不同季節的檢出率具有統計學意義(χ2=25.852，P＜0.05)，感染患者主要集中在夏秋季，具有較典型的季節性特征。

圖1 2015—2017年沙門菌的檢出數量Fig. 1 Number of detected Salmonella from 2015 to 2017

2.2 沙門菌血清型分布

108株沙門菌經血清學鑒定，可分為4個血清群，共17個血清型 ，其中以B群和D群為主，分別占67.59%和26.85%；B群以鼠傷寒沙門菌和斯坦利沙門菌居多，D群以腸炎沙門菌和都柏林沙門菌多見；檢出傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌和丙型副傷寒沙門菌各1株。不同血清型沙門菌分布詳見表2。

2.3 藥物敏感試驗

對108株沙門菌進行10種抗菌藥物的體外敏感試驗(表3)，此次實驗未發現對亞胺培南及哌拉西林/三唑巴坦的耐藥菌株，耐藥率前5位分別是氨芐西林(61.11%)、氨芐西林/舒巴坦(49.07%)、頭孢曲松(25.00%)、氨曲南(24.07%)及復方磺胺甲噁唑(20.37%)。105株非傷寒沙門菌中，對10種抗菌藥物均敏感的有27株(25.71%)，對3類及以上抗菌藥物耐藥的多重耐藥菌株有38株，耐藥率為36.19%(38/105)。

表2 108株沙門菌的血清型分布Tab. 2 Serotype distribution of 108 strains of Salmonella

檢出傷寒沙門菌及乙型副傷寒沙門菌各1株，均對10種抗菌藥物敏感；1株丙型副傷寒沙門菌對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦及復方磺胺甲噁唑表現為耐藥。

2.4 腸毒素基因

采用PCR擴增法對108株沙門菌進行腸毒素基因檢測。其中，108株沙門菌均為spvA陽性，34株為spvB陽性，28株為rck陽性(圖2～4)。根據腸毒素基因PCR擴增結果與患者臨床癥狀進行分組比較：spvB基因陽性患者其高熱、便血的比率較spvB陰性患者高，具有統計學差異(χ2=4.185,P＜0.05; χ2=6.13,P＜0.05)；rck基因陽性患者其高熱、便血的比率較rck陰性患者高，具有統計學差異(χ2=5.274,P＜0.05; χ2=8.887,P＜0.05)(表4～5)。

3 討論

本研究結果顯示，從4019例腹瀉患者中共分離出沙門菌108株，檢出率為2.69%，低于中山市區(5.00%)[3]與深圳地區(8.30%)[4]沙門菌的檢出率。其中于2015年檢出傷寒沙門菌、乙型副傷寒及丙型副傷寒沙門菌各1株，檢出率為0.07%，表明傷寒和副傷寒沙門菌等高致病性菌在人群中仍存在低水平的感染。中山市西北部區域非傷寒沙門菌引起的感染全年均可發生，高發季節主要集中在夏、秋兩季(7～12月)，具有明顯的季節性特征，與國內外各地區的季節分布相似[5-6]。本組數據顯示，108例沙門菌感染病例中，男女比例為1.7:1，≤1歲嬰兒占46.30%(50/108)，1～3歲幼兒占37.04%(40/108)，以嬰幼兒感染多見。嬰幼兒為易感人群，可能與嬰幼兒自身免疫系統發育尚不完善，飲食結構特殊及外在環境污染有關[7]。

表3 不同血清型沙門菌對10種抗菌藥物的耐藥情況(株數，%)Tab. 3 Resistance of different serotypes of Salmonella to 10 antimicrobial agents

圖2 spvA基因PCR電泳圖譜Fig. 2 PCR results for spvA gene

圖3 spvB基因PCR電泳圖譜Fig. 3 PCR results for spvB gene

圖4 rck基因PCR電泳圖譜Fig. 4 PCR results for rck gene

表4 spvB基因與患者臨床癥狀的關系Tab. 4 Relationship between spvB gene and clinical symptoms of patients

表5 rck基因與患者臨床癥狀的關系Tab. 5 Relationship between rck gene and clinical symptoms of patients

根據熱病指南建議[8]，對于無癥狀或癥狀輕微的非傷寒沙門菌感染患者可不必抗菌治療，但＜1歲或＞50歲、免疫功能低下、有特定疾病患者應積極進行抗菌治療。根據本次藥敏結果可看出，108株沙門菌對于頭孢曲松、復方磺胺甲噁唑、環丙沙星、氨曲南、亞胺培南，頭孢他啶、頭孢吡肟及哌拉西林/三唑巴坦的耐藥率均小于30%，而對氨芐西林的耐藥率則大于60%，說明氨芐西林不宜作為經驗治療的首選藥物。同時，熱病指南提出，在亞洲感染的患者應首選頭孢曲松或者阿奇霉素，不建議經驗使用氟喹諾酮類藥物，除非有藥敏結果指導。本研究顯示，沙門菌對于頭孢曲松的耐藥率為25.00%，當經驗治療用藥時，應謹慎選取。非傷寒沙門菌主要通過喹諾酮耐藥決定區(QRDR)的基因突變[9]，從而降低DNA-喹諾酮類藥物-DNA旋轉酶復合物的結合水平，提高了喹諾酮類藥物的耐藥性。環丙沙星屬于喹諾酮類抗菌藥物，是治療非傷寒沙門菌感染的有效抗菌藥物之一，除了QRDR基因突變以外，還可以通過質粒介導qnr基因產生耐藥性[10]。CHINET細菌耐藥性監測網[11]數據顯示環丙沙星耐藥率在2.4%～14.3%之間，與本文環丙沙星耐藥率(12.96%)相似，但比浙江地區[12](21.21%)及青島地區[13](18.03%)稍低。值得注意的是環丙沙星藥敏中介的菌株占13.89%(15/108)，與廣州地區[14]中介率(18.02%)相似，提示環丙沙星的藥物敏感性可能存在下降的趨勢，如果此類菌株在病房廣泛傳播，將會對疾病的抗感染治療提出嚴峻挑戰[15]。

多重耐藥的沙門菌是近年來公共衛生領域亟需解決的重要問題之一。本研究共檢出108株沙門菌，主要流行的沙門菌屬以鼠傷寒沙門菌多見，其次為斯坦利沙門菌和腸炎沙門菌，與中山市區[16]的血清型分布相似，但與廣州[14]、深圳[4]及浙江地區[12]存在一定差異。根據耐藥性分析結果可發現：近80.56%的沙門菌對至少一種抗菌藥物耐藥，35.19%的沙門菌表現為多重耐藥；其中鼠傷寒沙門菌對各種抗菌藥物的耐藥率明顯高于其他血清型沙門菌，36.96%的鼠傷寒沙門菌呈現多重耐藥，尤其在環丙沙星藥敏中介的菌株中該菌占26.67%(4/15)。因此，圍繞沙門菌血清型分布與細菌耐藥模式的持續性監測，有利于臨床的精準治療用藥，控制耐藥菌株的產生。

既往研究表明，沙門菌spv基因的表達，可延長細菌在宿主細胞內的存活時間[17]、通過影響細胞因子的分泌水平[18]、下調AcrA蛋白的表達[19]等，從而增強沙門菌的毒力及免疫抵抗能力，有利于躲避宿主的免疫防御。其中，spvB基因是對細菌毒力影響因素較大的結構基因之一。與此同時，侵襲因子rck可通過對人類補體的拮抗作用，從而增強沙門菌的侵襲能力。本研究結果顯示，從臨床分離的108株沙門菌中，spvA基因陽性為108株(陽性率100%)，spvB基因陽性為34株(陽性率31.48%)，rck基因陽性為28株(陽性率25.93%)，與國內相關報道相符[12]。spvB基因和(或)rck基因陽性患者，其高熱、便血的比率均顯著高于陰性患者，提示spvB基因及rck基因的表達，可加重患者的感染癥狀，甚至可引起全身性感染。

綜上所述，沙門菌感染是腹瀉患者的重要細菌性病原體之一，早期診斷及合理用藥是控制感染擴散的關鍵。建立持續有效的細菌耐藥監測體系，加強菌株的流行病學監測，及時分析菌株的藥敏特征及其相關基因，有助于進一步評估沙門菌感染的潛在風險，減少多重耐藥菌株的產生。