廣東省肇慶市肺炎克雷伯菌臨床分離株的耐藥性與MLST分型研究

蘇樂(lè)斌 李柏生 譚海芳 朱穎梅 林鳳 黎碧堅(jiān)

(1 肇慶市疾病預(yù)防控制中心，肇慶 526060；2 廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣州 511400)

肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae, KP)屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，革蘭陰性菌，是臨床上最常見(jiàn)的條件致病菌之一，可引起肺炎、尿路感染、血流感染等一系列感染性疾病。近20年來(lái)發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)重，產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶(ESBLsKP)及耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌(CRKP)的陸續(xù)出現(xiàn)，使得肺炎克雷伯菌成為院內(nèi)感染的主要致病菌[1]。同時(shí)，由高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)引起的社區(qū)性獲得性肺炎克雷伯菌感染也層出不窮[2-3]，。近年來(lái)，甚至發(fā)現(xiàn)一些產(chǎn)ESBLs的hvKP和其他類(lèi)型的多重耐藥hvKP患者[4-5]。高毒力同時(shí)攜帶多重耐藥性的肺炎克雷伯菌將給公共衛(wèi)生的防控和臨床患者的治療帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。本次研究通過(guò)對(duì)廣東省肇慶市2家醫(yī)院收集的63株肺炎克雷伯菌臨床分離株開(kāi)展體外抗生素敏感性試驗(yàn)與MLST，及時(shí)掌握本地區(qū)肺炎克雷伯菌的耐藥譜和菌群群落分布特征，有助于本地區(qū)醫(yī)院加強(qiáng)和改進(jìn)院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)和控制措施，合理使用抗生素，同時(shí)也為公共衛(wèi)生的防控提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株來(lái)源

收集2017年11月—2018年4月廣東省肇慶市2家醫(yī)院所有從住院患者分離到的肺炎克雷伯菌，共63株，所分離菌株均來(lái)源于痰、血、中段尿等患者標(biāo)本。經(jīng)VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，其中分析儀器由法國(guó)Bio-Mérieux公司生產(chǎn)。質(zhì)控菌株分別為：大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.2 主要儀器與試劑

VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析(法國(guó)Bio-Mérieux公司)，PCR儀(德國(guó)Senso Quest Labcycler公司)，革蘭陰性菌藥敏檢測(cè)板(上海星百醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)為A-3009XS、A-4009XS)，PrimeSTAR?Max DNA Polymerase試劑(大連寶生物科技公司，貨號(hào)為R045A)，血瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，貨號(hào)為024070)，質(zhì)控菌株分別為：大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.3 MLST管家基因引物

7個(gè)管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB)引物序列參照MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)。引物序列由上海生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 黏液拉絲試驗(yàn)

用接種環(huán)輕觸血瓊脂平板上過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌落向外牽拉，重復(fù)牽拉兩次。若兩次均有黏液絲形成并且長(zhǎng)度大于5mm，為黏液拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性菌株，即為hvKP。

2.2 藥物敏感性試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)使用商品化革蘭陰性菌藥敏檢測(cè)板，嚴(yán)格按廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并使用上海星百醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司的配套軟件判讀最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。

2.3 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

采用水煮法粗提DNA，PCR反應(yīng)體系為12.5μL PremixTaq，引物各1μL，模板1μL，無(wú)菌水10.5μL，總體積為25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，相應(yīng)溫度(7個(gè)位點(diǎn)的退火溫度除了gapA為60℃、tonB為45℃外，其余5個(gè)位點(diǎn)均為50℃)退火45s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，一個(gè)循環(huán)[10]。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，PCR產(chǎn)物陽(yáng)性的，送測(cè)序公司測(cè)序后，將序列提交到MLST官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)進(jìn)行比對(duì)，確定每株菌株的序列型(ST)。

2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析與建樹(shù)

通過(guò)在MLST官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)比較后，確定每株菌株的ST型，運(yùn)用Bio Numerics 7.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生產(chǎn)最小生成樹(shù)(MST)和耐藥譜圖。最小生成樹(shù)(MST)圖中每個(gè)圓的大小代表相同ST型的數(shù)量，黑實(shí)線代表2個(gè)ST型間管家基因有3個(gè)或3個(gè)以下的差異，黑實(shí)線越粗，2個(gè)ST型間的管家基因差異越小。虛線代表示有2個(gè)ST型間管家基因有4個(gè)或4個(gè)以上的差異，虛線點(diǎn)越密，2個(gè)ST型間的管家基因差異越大。在種群內(nèi)部可通過(guò)比較的等位基因圖譜之間的聯(lián)系，即緊密的相關(guān)的菌株， 其等位基因圖譜是相同或相近的，可被鑒定為一個(gè)序列組(STs)，無(wú)相關(guān)性的菌株的圖譜是沒(méi)有關(guān)聯(lián)的[6]。耐藥譜圖中黑色方格代表對(duì)該種抗生素耐藥，灰色方格代表對(duì)該種抗生素中度敏感，白色方格代表對(duì)該種抗生素敏感。

3 結(jié)果

3.1 菌株情況

本次研究收集的63株KP全部來(lái)源于患者，年齡以50歲以上的患者占了69.84%(44/63)，檢出菌株的科室以重癥監(jiān)護(hù)室(各類(lèi)ICU)為主，占55.30%(35/63)。臨床標(biāo)本類(lèi)型最多為痰占54.00%(34/63)，其次為血占22.20%(14/63)，中段尿占14.30%(9/63)，傷口分泌物占4.70%(3/63)，穿刺液占3.20%(2/63)，腹水占1.60%(1/63)。通過(guò)黏液拉絲試驗(yàn)分類(lèi)，拉絲實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株(hvKP)20株，分別來(lái)源重癥監(jiān)護(hù)室(各類(lèi)ICU)8株占40.00%(8/20)、泌尿外科2株占10.00%(2/20)、消化內(nèi)科2株占10.00%(2/20)、心內(nèi)科2株占10.00%(2/20)、婦科2株占10.00%(2/20)、呼吸內(nèi)科1株占5.00%(1/20)、腦病科1株占5.00%(1/20)、普外科1株占5.00%(1/20)、燒傷外科1株占5.00%(1/20)。

3.2 菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

63株肺KP菌株耐藥譜見(jiàn)圖1。由于KP對(duì)氨芐西林天然耐藥，20株hvKP對(duì)29種抗生素類(lèi)藥物絕大部分是敏感的，檢出率為31.74%(20/63)，其中耐藥譜為全敏感的有18株hvKP，1株hvKP(KP49)對(duì)四環(huán)素耐藥，1株hvKP(KP25)對(duì)四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑耐藥為多重耐藥菌，該株菌株分離自PICU患者；23株KP為ESBLsKP，檢出率為36.51%(23/63)，且23株ESBLsKP中大部分分離自重癥監(jiān)護(hù)室(各類(lèi)ICU)的患者，檢出率為47.83%(11/23)，其中有4株(KP09、KP10、KP22、KP13)對(duì)多黏菌素E耐藥，對(duì)多黏菌素B中度敏感，且KP09、KP10、KP22均分離自同一醫(yī)院，而KP13則分離自另一醫(yī)院；8株KP為CRKP，耐藥譜主要表現(xiàn)為對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥，檢出率為12.70%(8/63)，且8株CRKP中有7株分離重癥監(jiān)護(hù)室(各類(lèi)ICU)的患者，檢出率為87.50%(7/8)；剩余12株KP為多重耐藥菌MDRKP，耐藥譜表現(xiàn)為對(duì)3種或3種以上抗生素耐藥，檢出率為19.05%(12/63)，重癥監(jiān)護(hù)室(各類(lèi)ICU)檢出率為75.00%(9/12)。

3.3 多位點(diǎn)序列分型(MLST)結(jié)果

63株肺炎克雷伯菌MLST分型共發(fā)現(xiàn)41個(gè)ST型，其中ST37型有9株，ST11型5株，ST65型5株，ST23型3株，ST661型2株，ST1087型2株，ST1530型2株，ST2890型2株，其余ST型各1株。Bio Numerics軟件用于分析最小生成樹(shù)(MST)結(jié)果(圖2)， STs分布比較分散，普遍存在3個(gè)或3個(gè)以上的管家基因差異，而其中較大的STs有4個(gè)，分別是STs1(由ST37單獨(dú)組成)含9株產(chǎn)ESBLsKP，STs2(ST65、ST25、ST1135組成)含6株hvKP和1株MDRKP，STs3(由ST11和ST690組成)含6株CRKP，STs4(由ST23和ST218組成)含4株hvKP。菌株耐藥譜結(jié)合MLST發(fā)現(xiàn)，根據(jù)耐藥譜分類(lèi)的4類(lèi)KP都有主要的分子流行特性(圖3)：hvPK以ST23和ST65為主要流行型；ESBLsKP以ST37為主要流行型；CRKP以ST11為主要流行型；其他MDRKP的ST型呈多型別分散狀流行。

4 討論

肺炎克雷伯菌是臨床上常見(jiàn)的條件致病菌，在機(jī)體免疫力低下或長(zhǎng)期大量使用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)時(shí)，容易引起機(jī)會(huì)性感染。重癥監(jiān)護(hù)室、新生兒病房和老年病房是感染KP的高發(fā)區(qū)。hvKP除了引起肝膿腫，極易播散引起其他重要部位的轉(zhuǎn)移性感染且預(yù)后較差[7]，而多重耐藥KP引起院內(nèi)感染暴發(fā)流行后果更嚴(yán)重，死亡率高達(dá)40%[1]。本次研究對(duì)廣東省肇慶市兩家醫(yī)院的63株KP臨床分離株進(jìn)行了抗生素敏感性試驗(yàn)和MLST分型，分離株主要來(lái)源于ICU病房，以痰和血標(biāo)本為主，感染人群集中在50以上的中老年人，這與其他地區(qū)KP醫(yī)院感染特點(diǎn)類(lèi)似[1]。

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1)，63株肺炎克雷伯菌臨床分離株中除了19株hvPK對(duì)常用抗生素仍是敏感外，其余44株分離株對(duì)大部分抗生素耐藥比較嚴(yán)重，都是表現(xiàn)為ESBLsKP或CRKP或其他類(lèi)型MDRKP，這提示本地區(qū)主要醫(yī)療機(jī)構(gòu)中流行的都是具有強(qiáng)耐藥能力的肺炎克雷伯菌，需要加強(qiáng)醫(yī)院肺炎克雷伯菌院內(nèi)感染的監(jiān)測(cè)和防控。耐藥譜結(jié)合MLST分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，9株ST37型的ESBLsKP其耐藥譜存在差別，值得注意的是紅色方框內(nèi)的3株菌株(KP09、KP10和KP22)對(duì)多黏菌素E耐藥和多黏菌素B中度敏感，而紅色圓框內(nèi)的6株菌株(KP20、KP27、KP29、KP43、KP51、KP62)對(duì)多黏菌素E和多黏菌素B均敏感，KP09與KP43更是分離自同一醫(yī)院的同一個(gè)科室，多黏菌素作為目前臨床治療革蘭陰性菌感染的最后一道屏障，在多重耐藥革蘭陰性菌感染的治療中耐藥率低、治療效果好，特別是對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌效果顯著[8]，而本研究這一發(fā)現(xiàn)，提示我市大型綜合醫(yī)院里已開(kāi)始流行耐多黏菌素E的ESBLsKP，值得防控部門(mén)高度關(guān)注。而對(duì)MLST的最小生成樹(shù)(MST)分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，不同耐藥特征的KP有不同的菌落分布特性，hvPK以ST23和ST65為主要流行型，STs分布的比較集中，這與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的報(bào)道一致[9]，值得注意的ST25與ST65、ST1135分別都只有1個(gè)管家基因差異，親源關(guān)系非常密切，但耐藥譜分析顯示ST65與ST1135都是對(duì)抗生素全敏感的，ST25對(duì)7種抗生素耐藥，而KP14(ST25)與產(chǎn)ESBLs的KP52(ST17)間也只有2個(gè)管家基因差異，親源關(guān)系密切，而這8株菌株都分離自同一間醫(yī)院，KP14與KP52更是分離自同一間ICU病房，這提示該醫(yī)院可能存在優(yōu)勢(shì)的菌型，耐藥基因元件不僅在同ST型菌株間存在傳遞的風(fēng)險(xiǎn)，并且在不同ST型菌株間也同樣存在該風(fēng)險(xiǎn)；CRKP主要以ST11為主要流行型，ST型分布比較集中，主要在ST690周?chē)舜碎g的親緣關(guān)系比較近，與我國(guó)目前的主要流行型一致[10]，CRKP的耐藥譜顯示除了對(duì)碳青霉烯藥物耐藥外，至少還對(duì)14種藥物耐藥；ESBLs KP主要以ST37為主要流行型，分布同樣也相對(duì)集中，主要圍繞在KP05(ST35)周?chē)退幾V分布也顯示不同ST型間耐藥情況差別也不大，這提示該醫(yī)院存在這個(gè)菌型的優(yōu)勢(shì)克隆群；其他類(lèi)型MDRKP的ST型呈多態(tài)性分布。

圖1 63株肺炎克雷伯菌菌株耐藥譜表Fig. 1 Drug-resistant spectrum of 63 strains of Klebsiella pneumoniae

圖2 63株肺炎克雷伯菌最小生成樹(shù)(MST)Fig. 2 63 strains of Klebsiella pneumoniae MST

根據(jù)本文的研究結(jié)果，可見(jiàn)本地區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)KP臨床分離株的耐藥譜與菌落分布情況都各具特征，高毒力但抗生素敏感型的hvPK與多重耐藥的KP間呈現(xiàn)不同的菌落特征，同時(shí)不同菌落特征的菌株間存在耐藥元件相互傳遞的情況，而耐多黏菌素E的ESBLsKP出現(xiàn)尤其值得防控部門(mén)的高度關(guān)注，因此應(yīng)加強(qiáng)院內(nèi)肺炎克雷伯菌監(jiān)測(cè)，防止出現(xiàn)高毒力菌株獲得多耐藥基因元件后出現(xiàn)高毒力強(qiáng)耐藥的肺炎克雷伯菌。

圖3 4類(lèi)肺炎克雷伯菌分子流行特性圖Fig. 3 Molecular epidemic characteristics of 4 types of Klebsiella pneumoniae