教學用純化水皰性口炎病毒抗原制備兔多克隆抗體結果分析

胡 濤，李 群，劉伯玉

（安徽醫科大學，安徽 合肥 230032）

水皰性口炎病毒（VSV）可引起人畜共患疾病，是馬、牛和豬等口腔黏膜、乳頭、皮膚及蹄冠部皮膚出現水泡及糜爛為特征一種病毒性疾病，很少發生死亡[1]。人可通過與病畜接觸而感染，癥狀類似感冒，一周后康復并產生中和抗體[2]。根據VSV可使Vero細胞（非洲綠猴腎細胞）產生細胞病變效應（CPE）[3]，本實驗用純化的抗原制備了兔抗VSV多克隆抗體，采用雙向瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、中和試驗來測定血清效價。上述實驗方法是我國對病毒性疾病進行流行病學調查、疫病診斷、防疫檢測和免疫程序制訂等工作的主要實驗技術，也是目前高校醫學微生物學實驗課教學中學生操作的主要內容之一[4]，故通過建立實驗教學檢測方法的結果觀察分析，可為課堂教學、VSV科研及流行病學調查提供可靠依據和技術保障。

1 材料

1.1 病毒株與細胞株

VSV毒株、Vero細胞株均由安徽醫科大學微生物教研室提供。

1.2 動物

實驗用兔由安徽醫科大學動物中心提供。

1.3 試劑

完全佐劑和不完全佐劑由蕪湖天明生物科技有限公司提供，HRP標記羊抗兔IgM為北京中杉金橋生物技術有限公司產品；包被液、抗體稀釋液、顯色液、底物液、終止液、封閉液均由安徽醫科大學微生物教研室自制。

1.4 儀器設備

酶標儀（Biotek-EL808）、倒置生物顯微鏡（OLMPCUSCKX41）、CO2孵箱（日本株式社，日本）。

2 方法

2.1 純化VSV抗原的制備

將VSV毒株接種于Vero單層細胞，DMEM無血清維持液，48小時細胞病變（CPE）達80%以上時收獲病毒，4℃凍融3次，30 000 r/min，除去細胞碎片，上清液按文獻[5]純化抗原。經5 000 r/min離心30 min，取上清以30 000 r/min 4℃離心3小時，棄上清，將沉淀用少量PBS充分懸浮，獲得VSV病毒，測其濃度及毒力并分裝保存-80℃備用。

2.2 VSV抗原佐劑苗的制備

免疫前分別將弗氏完全佐劑和等量VSV抗原混勻，吸入20 mL注射器內，反復吹吸，直至形成黏稠的乳劑，滴于水上完全不擴散，不完全佐劑制備方法同上。

2.3 兔抗VSV多克隆抗體的制備

取體重為2～3 kg雄性、無感染疾患的兔共6只，分籠飼養，標明記號（a、b、c、d、e、f），實驗前進行健康觀察兩周。免疫前兔耳靜脈采血，分離血清，作為免疫血清陰性對照。免疫共5周，每周免疫注射家兔一次，第一次免疫VSV中加等量完全佐劑，采用多部位背部皮下注射2 mL VSV抗原，第二次抗原中等量加不完全佐劑，采用多部位腹部皮下注射2 mL VSV抗原，后3次免疫在兔耳靜脈注射1 mL VSV抗原，后一周心臟抽血離心分離血清測定效價。

2.4 兔抗VSV多克隆抗體的雙向瓊脂擴散試驗

實驗用滅菌1%NaCl溶液將配制成1%瓊脂液，將瓊脂融化，稍冷后傾注于清潔載玻片上，每張載玻片上4～5 mL。正六角形打孔，孔距3～5 mm，孔徑3～4 mm。將瓊脂板標明記號，分別稀釋待測血清原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。加樣：中央加1∶2的VSV抗原。其他6孔注入上述不同稀釋度免疫血清VSV。靜置：將上述瓊脂板平置于一個墊有濕紗布的盒內，于室溫24～48小時觀察結果。

2.5 兔抗VSV多克隆抗體的間接ELISA法

將上述純化VSV抗原，加96孔酶標板中做方陣滴定，獲合適濃度，用pH 9.6碳酸緩沖液包被抗原，設正常抗原孔，每孔75 μL，4℃過夜，10%牛血清封板1小時后，洗滌甩干備用。待測免疫血清分別按1∶10不同濃度倍比稀釋，每孔75 μL，放置37℃1小時，洗滌3次后，二抗為HRP標記羊抗兔IgM，用封板液稀釋1∶5 000，每孔75 μL，37℃ 1小時后洗滌3次。顯色：TMB A液及B液每孔各25 μL，與正?？乖妆容^，一般正常抗原孔不顯色，其他顯藍色為陽性。以未免疫血清作為陰性對照，以待測血清OD值/陰性對照OD值（P/N）2.1作為陽性標準，以出現陽性反應最高稀釋度作為該血清的抗體效價（滴度）。

2.6 兔抗VSV多克隆抗體的中和試驗測定效價

實驗前將預先被檢血清（a、b、c、d、e、f）和陰性對照血清于56℃滅活30 min。方法：將血清在微量細胞培養板上以2倍系列稀釋，血清稀釋從1∶4開始，每份血清使用兩排孔，第1孔加入100 μL，稀釋至第8孔吸出100 μL棄去。第9孔細胞對照，第10孔病毒對照，均不加血清，預先按文獻[6]配100TCID50VSV病毒懸液，按每孔100 μL加入，C細胞對照及血清S對照（即第1、9孔）不加病毒，V病毒對照加100TCID50100 μL。每孔總量200 μL，C對照及S對照補充稀釋液100 μL/孔。37℃ 1小時，分別將1×106/mL Vero細胞懸液100 μL加入每孔，37℃ CO2孵育，48小時觀察細胞病變效應（CPE）結果。

3 結果

3.1 VSV病毒的純化

將細胞培養的VSV用超速離心純化后，紫外分光光度計測其蛋白濃度為3.08 mg/mL。VSV接種Vero細胞的感染滴度為10-5/0.1 mL。

3.2 VSV抗原免疫接種后兔臨床癥狀

觀察兔發病，出現腹瀉、消瘦、食欲減退或不食等癥狀。唇、口腔黏膜等處出現水皰，水皰破潰，形成爛斑，局部的皮膚發生炎癥和脫毛。

3.3 兔抗VSV多克隆抗體的雙向瓊脂擴散試驗

觀察中間孔為VSV抗原，周圍孔為不同稀釋的免疫血清抗體，以出現沉淀線的最高稀釋為抗體效價，出現沉淀帶完全融合證明同種抗原，二者有部分相連表明二者有共同抗原決定簇，兩條沉淀線相互交叉說明二者抗原完全不同，結果見圖1。免疫血清檢測抗體效價結果分別為：a為1∶16、b為1∶16、c為 1∶32、d 為 1∶16、e 為 1∶16、f為 1∶32。

3.4 兔抗VSV多克隆抗體的ELISA法

兔抗VSV做方陣滴定的最佳工作濃度為1∶800（5.16wg/mL）；酶標二抗的最佳稀釋度為1∶5 000，6組VSV免疫血清IgM檢測結果見表1。

表1 VSV-雙向瓊脂擴散和ELISA及中和抗體試驗的結果比較

3.5 兔抗VSV多克隆抗體的中和試驗測定效價

用倒置生物顯微鏡觀察結果，首先觀察對照：V對照（＋＋＋＋）、S對照（－/＋－）、C 對照（－），以病變作為指標，能抑制病毒CPE的血清最高稀釋度為中和抗體效價（滴度）。6組VSV免疫血清中和試驗測定效價結果見表2、圖2。

表2 6組VSV免疫血清中和試驗CPE測定效價結果觀察

圖2 中和試驗（A細胞對照；B VSV滴度；C血清對照；D病毒對照）

3.6 兔抗VSV多克隆抗體實驗方法結果的分析比較

6份血清中，雙向瓊脂擴散試驗和間接ELISA與病毒中檢測結果相符，見表1。其中雙向瓊脂擴散試驗出現沉淀帶完全融合證明同種VSV抗原，中和試驗結果顯示病毒回歸成立，正常對照細胞生長良好。觀察VSV免疫血清中和效價和間接ELISA效價，通過結果可見這兩種方法檢測血清的陰性對照、陽性對照是一致的。

4 討論

上述實驗證明，兔可被VSV感染導致出現臨床癥狀，可用來研究病毒致病性與實驗結果之間的關系。研究表明，實驗采用純化的全病毒免疫兔，可獲得抗VSV所有結構蛋白的特異性抗體，而抗體的效價和純度是影響ELISA敏感性的因素[7]，因此，對抗VSV進行了純化，最大可能地降低了非特異性反應，從而提高了敏感性。純化VSV能夠被兔抗VSV陽性血清阻斷，而不被兔抗VSV陰性血清阻斷，雙向瓊脂擴散和ELISA及中和抗體試驗的方法，表明該方法在檢測其他相關病毒時不發生交叉反應，特異性良好。

建立上述實驗方法是醫學微生物學不同專業學生綜合實驗課的主要內容之一，包括高校八年制本博連讀學生臨床醫學專業開設“病毒分離培養、鑒定及血清流行病調查”，研究生開設“細胞培養技術與傳染病預防診斷”，衛生檢驗專業學生開設“動物免疫血清的制備與檢測方法”實驗課的內容，通過這些實驗主要內容，學生可以通過這些實際操作觀察分析病毒的免疫學檢測方法結果，使本科生和研究生更好地熟悉和掌握傳染病的診斷、治療和預防等教學實踐性內容，也可為血清學的檢測提供依據。