藥用植物內生真菌抗腫瘤代謝產物研究進展

賈力維，王謙博，張爽，王振月*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510000)

由于天然產物在自然界中具有特定的功能，因此從天然產物中篩選生物活性成分成為發現新藥的有效途徑之一。植物歷來是篩選天然藥物最主要的來源，但藥用植物面臨生長周期長、野生藥用植物資源分散、人工栽培藥用植物占用農業資源等問題。

內生真菌是共生于健康植物組織內而不引起植物病變和排斥的真菌[1]，普遍存在于植物的各種組織、器官及細胞間隙當中，具有豐富的生物多樣性。內生真菌在與植物共同進化過程中獲得了與宿主相同或相似次生代謝產物的能力，其代謝產物具有多種生物活性，包括促進植物生長[2]、抗菌[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]等。特別是具有抗腫瘤作用的次生代謝產物，因其結構相對新穎，代謝產物類型豐富，因此成為抗腫瘤活性分子的天然寶庫。

本文從結構的角度將不同類型植物內生真菌次級代謝產物進行歸類，并對典型的抗腫瘤活性物質進行總結(見表1)，以期為植物內生真菌的研究提供參考。

1 抗腫瘤內生真菌次級代謝產物

1.1 生物堿

生物堿是植物中常見的一類含氮有機化合物，在植物內生真菌次級代謝產物中亦占有重要地位。生物堿具有復雜的環狀結構和顯著的生理活性，因植物內生真菌中最早發現具有抗腫瘤作用的長春新堿等屬于生物堿而備受關注。

Sherif等[6]從埃及水葫蘆Pontederiaceae葉片分離得到內生真菌spergillus versicolor KU258497，并從其發酵產物中分離到兩個新的異香豆素二聚體6,6′,9′-Trinor-bipenicilisorin、6,6′-Dinor-bipenicilisorin和一個新的二氫喹諾酮衍生物Aflaquinolone H。通過MTT法驗證發現,Aflaquinolone H對小鼠淋巴瘤L5178Y細胞系具有明顯的細胞毒活性，IC50值為10.3 μM。

Ramsay等[7]從橢圓烏桕Sapium ellipticum的根部分離出一株柱孢屬內生真菌Cylindrocarpon sp.通過將菌株在固體培養基上連續培養28天，獲得9.2 g次級代謝產物。從中分離出兩種新的吡啶酮生物堿，一種新的吡咯烷酮，以及7種已知化合物。Pyrrocidine A對人卵巢癌細胞株A 2780有較強的細胞毒性作用，其IC50值為1.7 μM。

Na Gao等[8]從植物半夏的根部獲得一株短柄青霉屬內生真菌Penicilliumbrefelum，并采用大米培養基對內生真菌進行培養，從培養物中分離到3種新的生物堿6,7-dehydropaxilline,spirotryprostatin F 和 N-demethylmelearoride A。這些代謝物對3種腫瘤細胞MDA-MB-231，U2-OS，HepG2表現出不同的細胞毒活性。spirotryprostatin F對HepG2和MDA-MB-231細胞具有較為理想的殺傷作用。IC50值分別為14.1 μg/L和35.5 μg/L。N-demethylmelearoride A對HepG2細胞具有中等活性，IC50值為36.6 μ/L[9]。

1.2 甾體

甾體化合物是天然產物中最廣泛出現的成分之一，幾乎所有生物體自身都能生物合成甾體化合物，并具有各種生物活性。雖然目前甾體類化合物對抗腫瘤的研究有限，但以其豐富的自然資源能為抗腫瘤藥物的研發提供雄厚的物質基礎。

Wu等[11]從中國紅豆杉 Taxus chinensis的內生真菌Perenniporia tephropora Z41 的發酵液中分離得到對3種人癌細胞系(HeLa，SMMC-7721和PANC-1)均有細胞毒活性的化合物，其中ergosterol的細胞毒性最強，IC50值分別為1.16 μg/mL，11.63 μg/mL和11.80 μg/mL。

1.3 萜類

萜類化合物就是指存在自然界中、以甲戊二羥酸衍生而成的、基本碳架具有2個或者2個以上的異戊二烯結構特征的化合物。萜類化合物可以分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜及三萜等。

紫杉醇是一種高度功能化的多環二萜類化合物，能夠治療多種腫瘤，包括乳腺、卵巢和卡波西肉瘤，被認為是有史以來最暢銷的癌癥藥物(Gordon，2011年)[12]。實際上今天對內生真菌的研究熱潮，就是從1993年Stierle等發現短葉紫杉內生真菌具有產紫杉醇的功能開始的[13]。

Chinworrungsay等從泰國藥用植物Knema Laurina的枝條中分離出一種內生真菌Acremonium。通過其真菌發酵產物獲得布雷菲德菌素A、8-脫氧三尖杉酯堿、三羥基鞘氨醇、7-羥基三萜醇、7-羥基三尖杉酯。布雷菲德菌素A對KB、BC-1和NCI-H 187具有較強的細胞毒活性，IC50值分別為0.18 μM、0.04 μM和0.11 μM[14]。

Isaka等從木本植物Licula spinose中得到內生真菌Xylaria sp，并從其發酵液內獲取7個倍半萜類化合物。其中Eremophilanolide 1對KB、MCF 7細胞系的IC50值在3.8～21 μM之間[15]。

Liu等從茶樹(Camellia Sinensis)分離到了植物內生真菌Pestalotiop fici。通過發酵獲得7種新的異戊二烯化色酮衍生物pestaloficiols F-L，在已分離出的化合物中，pestaloficiols J、pestaloficiols K、pestaloficiols L對HeLa細胞具有殺傷作用，IC50值在8.7 μM～99.3 μM之間。其他化合物對HeLa細胞的IC50值在8.7 μM～>136.1 μM之間。

純電動汽車是電力驅動的一種新能源汽車，純電動汽車適合慢速行駛，這種汽車在停車狀態下不會消耗過多的電能，其主要以發電機為制動電機，因此，可借助減速時的能量來減少石油資源的消耗量。同時，其他能源可轉化為車輛行駛所需的電能，維修保養工作相對簡單，且工作壓力較小。但是蓄電池容量有限，且價格較高，需要完善的基礎設施支持，故而該類型汽車的投資較高。

Bhatia等從內生真菌 Bipolaris setariae 發酵液中分離出的抗癌物質 Ophiobolin A對實體癌和白血病細胞有較好的抑制作用，IC50值分別為0. 4 μM 和4.3 μM。通過對相關通路蛋白的研究發現,Ophiobolin A的抗癌活性可能與PI3K/mTOR、Ras/Raf /ERK 和CDK/RB 的抑制有關[16]。

1.4 黃酮類

黃酮是一類廣泛存在于藥用植物中的活性物質，其基本母核為2-苯基色原酮,且大多呈現黃色或者淡黃色，故將此類物質稱黃堿素或黃酮。研究表明，黃酮及查耳酮衍生物都表現出逆轉耐藥性的能力，因此黃酮類化合物可以作為一種潛在的腫瘤治療輔助藥物，為臨床腫瘤治療提供新的思路。

Isaka等[17]從柚木(Tectona grandis)中分離得到擬莖點霉屬內生真菌BCC 1323，采用液體發酵的方法從培養液中分離得到2種活性物質phomoxanthone A和phomoxanthone B，這些化合物對KB、bc-1、Vero細胞具有明顯的細胞毒性作用。phomoxanthone A對這三種細胞的IC50值分別為0.99、0.51和1.4 μg/mL；phomoxanthone B對這三種細胞的IC50值分別為4.1、0.71和1.8 μg/mL。

Xia-Nan Sang等[18]從內生真菌Phomasp中分離到4個新的α-Pyrone衍生物，測定了化合物對人白血病HL-60、人前列腺癌pc-3和人結腸癌hct-116的細胞毒活性。Phomone D和Phomone E對這3種細胞具有明顯的抑制作用，其IC50值在0.65 μM～9.84 μM之間。

Deshmukh等從牛乳樹的葉片內生真菌Ascomycetes中分離得到一種麥角黃酮Ergoflavin，Ergoflavin屬于麥角黃素中的一種。體外實驗發現,Ergoflavin可以抑制人腫瘤壞死因子TNF-α和 IL-6，IC50值的抑制作用分別為1.9 μM和1.2 μM。進一步的研究表明，Ergoflavin對ACHN、NCI-H 460、PANC-1、HCT 116和Calu 1細胞均有細胞毒性作用，IC50值分別為1.2 μM、4.0 μM、2.4 μM和8.0 μM[19]。

Sun等從野生地黃的根部提取內生真菌 Massrison sp，從發酵液中提取出 Masarigenin D、spiromassaritone和Pecilospirone，這些化合物含有罕見的Spiro-5，6-內酯環骨架。通過進一步的研究發現,這3種化合物對 LO2、HepG2、MCF7及A-2細胞有較強的細胞毒性。 其中Spiromassaritone對以上4種細胞都有比較理想的抑制作用， IC50值在5.6～9.8 μg/mL之間[20]。

Chen等從中藥雷公藤葉中分離到內生真菌青霉菌HSZ-43，并發現該內生真菌產生一種新的化合物Penifupyrone以及3個已知的類似物：真菌酮、脫氧真菌酮和3-O甲基真菌酮。將分離的化合物對KB細胞的細胞毒性進行的測試結果表明,Penifupyrone具有中等細胞毒性，IC50值為4.7 μM，真菌酮、脫氧真菌酮和3-O-甲基真菌酮的IC50值分別為13.2、22.6和35.3 μM[21]。

1.5 酯類

Shiono等[22]研究發現,內生真菌菌株Allantophomopsis lycopodina能產生一種新的天然產物Allantopyrone A和一種已知的島狀酸-Ⅱ甲酯，這2種化合物均具有良好的抗細胞毒活性。HL60細胞的IC50值分別為0.32 μM和6.55 μM。后續的研究發現這些化合物作用于HL60細胞的機制可能是其誘導基因組DNA的切割，導致形成DNA含量較少的亞二倍體細胞從而導致細胞凋亡[23]。

Yokoigawa等從內生真菌 Allantophomopsis lycopodina KS-97的代謝產物中獲得了新的化合物 allantopyrone A，對HL-60 細胞具有較高的細胞毒性，后續研究中證明allantopyrone A誘導DNA 片段化，并可以通過抑制 IkBa 磷酸化的過程從而阻礙 NF-κB 信號傳導途徑，最終發揮抑制腫瘤的作用[24]。

1.6 蒽醌

蒽醌類化合物是天然醌類化合物中數量最多也是最重要的一類化合物，在天然藥物中存在廣泛且具有重要的生物活性，尤其抗腫瘤活性以其天然低毒、高效的特點，備受國內外學者關注。

Jittra等從南酸棗(Choerospondias axillaris)的葉片分離得到一株內生真菌Nigrospora sp. BCC47789，用馬鈴薯培養基及麥芽培養基接力培養得到9.03 g次級代謝產物。從中分離得到新的氫蒽醌nigrosporone A、nigrosporone B，以及11個已知的化合物。nigrosporone B具有廣泛的生物活性包括抗瘧、抗結核、抗菌和細胞毒性，其對NCI-H187和Vero兩種細胞的IC50值分別為0.25 μM和0.72 μM，而nigrosporone A僅顯示出細胞毒性作用[25]。

Pompeng等從泰國刺桐的健康葉片上獲得到一株鏈格孢內生真菌，通過其代謝產物分離得到一種羥基化四氫蒽醌Altersolanol，Altersolanol通過抑制內皮細胞增殖和遷移獲得較強的抗血管生成活性。實驗證明,Altersolanol能抑制血管的形成，因此這種內生真菌代謝產物是治療癌癥和其他促血管生成相關疾病的潛在候選藥物[26]。

1.7 其他化合物

Wu等從紅樹林植物老鼠簕的新鮮葉片中分離得到Aspergillus sp. HN15-5D，并從其發酵產物中得到3個新異香豆素衍生物，其中Aspergisocoumrins A及Aspergisocoumrins B顯示出對人乳腺細胞MDA-MB-435較強的細胞毒性，其IC50值分別為5.08 μM和4.98 μM。這2種物質對MCF10A亦有較強的細胞毒性，IC50值分別為11.34 μM和21.40 μM[27]。

Ken-ichi等從黃柏葉片中提取其病原菌Diaporthe sp. ECN-137并分離得到2個二苯基醚衍生物Diaporthols A和Diaporthols B，這2種化合物在MB-MB-231型乳腺癌細胞的劃痕實驗中表現出明顯的抗細胞遷移作用，在濃度為20 μM時可以明顯抑制細胞遷移。這提示其可能是腫瘤轉移的抑制因子[28]。

Mohamed等從木薯葉中分離到一株內生真菌Aspergillus glaucus，其發酵產物中分得2,14-dihydrox-7-drimen-12,11-olide。該化合物對HepG2細胞有中等的細胞毒作用，IC50值為61 g/mL，對MCF 7細胞具有良好的細胞毒作用，IC50值為41.7[29]。

Devari等[30]從辣椒中分離Alternaria alternata內生真菌，并從內生真菌發酵產物中分離得到Alternariol-10-methyl ether。Devari課題組對分離得到的化合物進行了詳盡的細胞毒性測試，Alternariol-10-methyl ether表現強大的抗增殖活性，對人類癌癥細胞HL-60、A431、A549、PC-3、HeLa、MIC-PACA-2和T47 D均有抑制作用。凋亡小體的形成、線粒體膜電位的喪失和基因組DNA的斷裂是細胞凋亡過程中典型的形態學和電化學變化[31-32]。后續的研究表明,用Alternariol-10-methyl ether處理HL-60時，可以觀察到核形態的變化和線粒體膜電位的喪失，并對內生真菌代謝產物的抗腫瘤機理進行了深入的研究。

2 小結

自從產紫杉醇內生真菌被發現以來，內生真菌已經成為生物活性物質的特殊來源，內生真菌的次生代謝產物已被廣泛應用。對內生真菌的持續開發，使克服植源性藥物資源匱乏成為可能。隨著對內生真菌抗癌特性的了解和“組學”以及發酵技術的最新進展，內生真菌必然在降低抗癌藥物成本、提高藥物療效和降低抗癌藥物副作用等方面發揮更大的作用。在內生真菌代謝過程中引入分子生物學的嘗試、對內生真菌的菌株改良，都將使內生真菌成為未來潛在的抗癌藥物來源。因此，探索和開發植物內生真菌次級代謝產物是發現抗癌特效藥物的一個極好的途徑。

表1 植物內生真菌抗腫瘤活性成分

續表1