蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維酶法提取及抗氧化活性研究

張博華 ，張明 ，楊立風(fēng) ，門慶永 ，陳彩霞 ，王崇隊 ，馬超 *

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014；2.山東恒寶食品集團有限公司，山東日照276500）

膳食纖維是指不易被人體消化吸收的食物營養(yǎng)素，被稱為第七大營養(yǎng)素，包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等。膳食纖維具有多種功效，能增加飽腹感；調(diào)節(jié)血糖平衡，預(yù)防糖尿病；調(diào)整腸道菌群，預(yù)防便秘和改善心腦血管疾病[1]。根據(jù)其能否在熱水或溫水中溶解，又分為可溶性膳食纖維（Soluble dietary fiber，SDF）和不可溶性膳食纖維（Insoluble dietary fiber,DF）。對人體起主要功效的是可溶性膳食纖維，包括葡聚糖、果膠、樹膠、藻膠、豆膠、瓊脂和羥甲基纖維素等[2]。可溶性膳食纖維既能溶解于水，又能吸水膨脹，并能被大腸中微生物降解。可溶性膳食纖維可增加飽腹感、降低脂肪的熱比值，避免體內(nèi)脂肪的過度積累，達(dá)到控制體重的目的[3]。

目前針對可溶性膳食纖維的提取研究主要集中在單一物料上，復(fù)合物料可溶性膳食纖維的提取研究還較少。研究發(fā)現(xiàn)，多種膳食纖維復(fù)合作用效果比單一膳食纖維更佳，且復(fù)合膳食纖維的組合作用并不是簡單地相加作用，而是存在復(fù)雜的協(xié)同關(guān)系。此外，復(fù)合可溶性膳食纖維提取對工廠化生產(chǎn)具有積極影響，可減少重復(fù)的提取環(huán)節(jié)，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。本研究在前期調(diào)研的基礎(chǔ)上，選取西藍(lán)花、苦瓜、魔芋、金針菇四種蔬菜作用原料[4]，采用淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等生物酶制劑進(jìn)行蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維的提取研究，通過正交優(yōu)化試驗確定最佳提取工藝，并對其抗氧化活性進(jìn)行分析，以期為蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維的提取及綜合利用提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

西藍(lán)花、苦瓜、金針菇、魔芋，均購于山東恒寶食品集團有限公司。

α-高溫淀粉酶（40000 U/g）、蛋白酶（50000 U/g）、糖化酶（100000 U/g）、DPPH，美國 Sigma公司。無水乙醇、鹽酸、硝酸銀、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、氯化亞鐵、硫酸鐵、水楊酸、雙氧水等均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ME104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；pHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器，江蘇杰瑞爾電器有限公司；pHP-250A型高速多功能粉碎機，浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；UV1000紫外分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取工藝流程

原料復(fù)配→蒸餾水混勻→高溫淀粉酶90℃酶解→冷卻→蛋白酶45℃酶解→調(diào)整pH→60℃糖化酶酶解→加熱滅酶→離心→取上清液→醇沉→抽濾→干燥→蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維。

1.2.2 工藝操作要點

稱取苦瓜、魔芋、西藍(lán)花、金針菇四種原粉各1 g，進(jìn)行復(fù)配，加入一定量的蒸餾水混勻并水浴加熱到90℃?zhèn)溆谩Ｔ谠弦后w中加入淀粉酶溶液，90℃酶解一段時間。酶解結(jié)束后冷卻至45℃，并加入蛋白酶進(jìn)行酶解。待酶解完成立刻調(diào)整pH到4.0～4.5，達(dá)到糖化酶的最適pH，同時使蛋白酶滅活。加入糖化酶25 U/g，60℃酶解60 min，之后加熱滅酶。樣品液離心取上清液，用無水乙醇提取可溶性膳食纖維，抽濾烘干得到蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維。

1.2.3 單因素試驗

在高溫淀粉酶最適溫度（90℃）與pH（5.5）條件下，分別考察高溫淀粉酶的加入量（50、100、150、200、250 U/g）、酶解時間（20、40、60、80、100 min）；在最適溫度（60℃）最適pH（5.5）條件下，分別考察蛋白酶的加入量（375、750、1125、1500、1875 U/g）、酶解時間（20、40、60、80、100 min）；料液比（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100）對四種蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率的影響。

1.2.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，分別選取高溫淀粉酶的添加量、淀粉酶酶解時間、蛋白酶添加量、蛋白酶酶解時間四個因素，以復(fù)合可溶性膳食纖維的提取率為測定指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗[5]。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 可溶性膳食纖維提取得率計算

式中：c為測得復(fù)合可溶性膳食纖維濃度，mg/mL；

n為稀釋倍數(shù)；

v為復(fù)合可溶性膳食纖維溶液體積，mL；

m為復(fù)合原料質(zhì)量，mg。

1.3.2 抗氧化活性的測定

將蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維、西藍(lán)花可溶性膳食纖維、金針菇可溶性膳食纖維、魔芋可溶性膳食纖維、苦瓜膳食纖分別配置成 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL 的樣品溶液，進(jìn)行DPPH自由基清除活性、羥自由基清除活性和還原能力的測定。

（1）DPPH自由基清除活性測定

取2 mL的樣品溶液和2 mL、0.2 mmol/L DPPH溶液放入試管中，充分混合后避光靜置30 min，在517 nm處測定其吸光度A1。同法測定2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇混勻后的吸光度A2和2 mL DPPH溶液加入2 mL蒸餾水的吸光度A0，同時用VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。

（2）·OH自由基清除活性測定

取不同濃度的可溶性膳食纖維樣品溶1 mL分別加入到試管中，分別依次加入1 mL、8 mmol/L FeSO4溶液，1 mL、8 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，1 mL、8 mmol/L H2O2。充分混勻后靜置1 h，在510 nm處測定吸光值A(chǔ)4。同樣方法，用蒸餾水替代樣品測得吸光度A；用蒸餾水替代H2O2測得吸光度A3，同時用VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對照[6]。

（3）還原力測定

取不同濃度的可溶性膳食纖維樣品溶液0.5 mL，加入2.5 mL、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6、0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液62.5 mL+0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液37.5 mL）和2.5 mL、1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50℃溫度水浴保溫20 min，然后加入2.5 mL、10%的三氯乙酸溶液、5 mL蒸餾水和1 mL、0.1%氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10 min，以無水乙醇代可溶性膳食纖維提取液按上述處理作空白對照，于700 nm波長處測定吸光度[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 淀粉酶添加量對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取得率的影響

圖1 淀粉酶添加量對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取得率影響Fig.1 Effect of amylase addition amount on extraction rate of SDF from compound vegetables

圖1（見上頁）顯示了高溫淀粉酶添加量對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取得率的影響。由圖可知，當(dāng)高溫淀粉酶的添加量在0～200 U/g之間時，復(fù)合可溶性膳食纖維提取率呈現(xiàn)上升趨勢，說明在此加酶量范圍內(nèi)，加酶量越多，溶出的可溶性膳食纖維越多。但是當(dāng)加酶量高于200 U/g時，復(fù)合可溶性膳食纖維提取率曲線變化較小，略有下降。因此，高溫淀粉酶最適的添加量為200 U/g。

2.1.2 蛋白酶添加量對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取得率的影響

圖2顯示了蛋白酶添加量對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取得率的影響。由圖可知，當(dāng)?shù)鞍酌傅奶砑恿吭?～1125 U/g之間時，復(fù)合可溶性膳食纖維提取率呈現(xiàn)上升趨勢。說明在此加酶量范圍內(nèi)，加酶量越多，溶出的可溶性膳食纖維越多。但是當(dāng)加酶量高于1125 U/g時，復(fù)合可溶性膳食纖維提取率曲線略有下降。因此，蛋白酶最適添加量為1125 U/g。

圖2 蛋白酶添加量對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取得率影響Fig.2 Effect of protease addition amount on extraction rate of SDF from compound vegetables

2.1.3 淀粉酶反應(yīng)時間對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取得率的影響

圖3顯示了高溫淀粉酶反應(yīng)時間對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率的影響。由圖可以得出，當(dāng)酶處理時間小于60 min時，復(fù)合可溶性膳食纖維提取率隨著處理時間的增加而明顯上升；當(dāng)酶處理時間超過60 min時，復(fù)合可溶性膳食纖維提取率變化平穩(wěn)。故淀粉酶酶解的最佳處理時間為60 min。

圖 3 高溫淀粉酶反應(yīng)時間對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率影響Fig.3 Effect of amylase reaction time on extraction rate of SDF from compound vegetables

2.1.4 蛋白酶反應(yīng)時間對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率的影響

圖4顯示了蛋白酶反應(yīng)時間對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率的影響。由圖可以得出，當(dāng)?shù)鞍酌傅奶幚頃r間小于60 min時，復(fù)合可溶性膳食纖維提取率隨著處理時間的增加而明顯上升；當(dāng)?shù)鞍酌傅奶幚頃r間超過60 min時，復(fù)合可溶性膳食纖維提取率呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢。故蛋白酶酶解的最佳處理時間為60 min。

圖4 蛋白酶反應(yīng)時間對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率影響Fig.4 Effect of protease reaction time on extraction rate of SDF from compound fruit and vegetable

2.1.5 料液比對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率的影響

根據(jù)圖5可知，料液比對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率隨料液比的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)料液比在1:40時達(dá)到最高，當(dāng)料液比過高時蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率開始下降，這可能是因為在料液比1:40時樣品中可溶性膳食纖維已經(jīng)完全溶出。當(dāng)料液比過大時不利于后期的提取，導(dǎo)致提取率緩慢下降。因此料液比選擇1:40左右為宜。

圖5 料液比對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率的影響Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of SDF from compound vegetables

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)淀粉酶添加量、蛋白酶添加量、淀粉酶反應(yīng)時間、蛋白酶反應(yīng)時間四個因素對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維的提取率影響較大，因此進(jìn)行L9(34)正交試驗，各因素水平設(shè)計見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental design

由表2可以看出，各因素對蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取率的影響大小順序為：B（蛋白酶添加量）＞A（淀粉酶添加量量）＞D（蛋白酶酶解時間）＞C（淀粉酶酶解時間）。復(fù)合酶法提取蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維的最佳工藝為A2B2C2D2，即淀粉酶添加量200 U/g，蛋白酶添加量1125 U/g，淀粉酶酶解時間60 min，蛋白酶酶解時間60 min。通過進(jìn)一步驗證，在此條件下，蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取得率為4.97%，均高于其他試驗組。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal design

2.3 抗氧化活性

2.3.1 對DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，甲醇溶液顯紫色，自由基清除劑能夠與DPPH的單電子配對，在最大吸收波長處顏色變淺，吸光度也會隨之變小，DPPH自由基清除率越高，表明其抗氧化能力越大。由圖6可知，苦瓜、金針菇、魔芋、西藍(lán)花與復(fù)合可溶性膳食纖維對DPPH自由基的清除能力隨著可溶性膳食纖維質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，在質(zhì)量濃度為3 mg/mL時，復(fù)合可溶性膳食纖維清除率最高達(dá)到82.42%，高于其它4種單一組分。

2.3.2 對·OH自由基的清除能力

由圖7可知，復(fù)合蔬菜可溶性膳食纖維對·OH自由基的清除能力隨著可溶性膳食纖維質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。復(fù)合可溶性膳食纖維在質(zhì)量濃度3 mg/mL時清除率最高，可達(dá)57.97%，高于西藍(lán)花、苦瓜、魔芋、金針菇這4種可溶性膳食纖維的清除率。

2.3.3 還原力

圖8 可溶性膳食纖維總還原能力對比Fig.8 Contrast of total reducing ability of SDF from compound vegetables

由圖8可知，苦瓜、金針菇、魔芋、西藍(lán)花與復(fù)合可溶性膳食纖維均具有一定的還原能力，并隨著可溶性膳食纖維質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。且在一定濃度范圍內(nèi)，苦瓜、金針菇、魔芋、西藍(lán)花四種單一組分的還原能力要高于復(fù)合組分，其中金針菇的還原力最強。

3 結(jié)論

通過正交試驗方法優(yōu)化了蔬菜復(fù)合膳食纖維的提取工藝，最佳工藝參數(shù)為淀粉酶添加量200 U/g，蛋白酶添加量1125 U/g，淀粉酶酶解時間60 min，蛋白酶酶解時間60 min。在此條件下，蔬菜復(fù)合可溶性膳食纖維提取得率為4.97%。

提取所得的蔬菜復(fù)合膳食纖維具有一定的抗氧化能力，在質(zhì)量濃度為3 mg/mL時，復(fù)合可溶性膳食纖維DPPH自由基清除率、·OH自由基清除率分別為82.42%、57.97%，均高于金針菇、苦瓜、魔芋這3種單一可溶性膳食纖維。蔬菜復(fù)合膳食纖維具有一定的還原能力，且在一定濃度范圍內(nèi)，單一組分的還原能力要高于復(fù)合組分。