梓樹內生解淀粉芽孢桿菌GZ-5發酵條件的優化及其促生作用測定

王 勇，朱洪磊，郭潔心，馬 超，張寶俊

（山西農業大學農學院，山西太谷 030801）

應用微生物次級代謝產物來防治植物病害是當前生物防治的主要發展趨勢之一[1-4]。植物內生細菌是定殖在健康植物組織內，并與植物建立和諧聯合關系的一類微生物，具有促進植物生長、生物固氮、抗病蟲害以及增強寄主植物對不良環境條件的適應能力等多種生物學作用[5-6]，尤其是內生拮抗細菌可以產生脂肽、抗菌蛋白等多種物質，是一類重要的生防資源。辛玉成[7]從蘋果果實表面分離到1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XM16，通過試驗證明，其對蘋果霉心病、枝干病害等植物真菌病害有顯著的防治效果。張文芝[8]從番茄根際土壤中分離獲得 1株蠟質芽孢桿菌（Bacillus cereus）AR156，該菌株對根結線蟲有很好的防治效果。邱思鑫等[9]從茄科作物體內分離篩選出1株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TB2，對黃瓜枯萎病菌、番茄青枯病菌和辣椒疫病菌都有較好的拮抗作用。

為了提高菌株抑菌活性物質的產量，增加其防治效果，王哲等[10]采用單因素多濃度試驗和響應面設計法，對解淀粉芽孢桿菌KLBMP-033的發酵條件進行了優化，其優化后的發酵物對可可球二孢的抑菌率從53.3%提高到了83.2%。周青等[11]對解淀粉芽孢桿菌BS2004的培養條件進行優化后，青枯病菌的抑菌圈直徑達到21.75 mm，對番茄青枯的防治效果達80%，對十字花科根腫病的防效達60%，可促進作物增產192%。

本研究前期從梓樹上分離到1株對番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌等多種病原菌有較好拮抗作用的內生細菌GZ-5，經初步鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。為進一步提高其生防效果、降低發酵成本、開發其應用價值，通過測定在不同條件下抗病促生菌的菌體生長量和芽孢數優化其發酵條件，并通過盆栽測定了GZ-5菌株的促生作用，以期為該菌株的開發及利用奠定試驗基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌GZ-5菌株為山西省植物內生菌服務共享平臺分離純化菌種，保存于山西省綠色生物農藥工程技術研究中心。

1.1.2 供試培養基 NA培養基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉 16 g，pH 值 7.0，蒸餾水定容至1 000 mL。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，定容至 1 000 mL。

LB培養基：蛋白胨10g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，NaCl 12 g，pH值7.0，蒸餾水定容至1 000 mL。

NB培養基：牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH值7.0，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 最佳碳源的篩選

1.2.1.1 種子發酵液制備 將GZ-5菌株活化后接種于NB培養液中，30℃，160 r/min振蕩培養12 h獲得種子發酵液。

1.2.1.2 碳源設置 以LB為基礎培養基，分別以淀粉、乳糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖等替換培養基中的碳源，并按照1%的接種量，分別接入GZ-5菌株種子液，于30℃條件下，160 r/min振蕩培養48 h后測定各處理發酵液中的芽孢數和菌體生長量。3次重復。

1.2.1.3 芽孢含量和菌體生長量測定 將待測樣品置于80℃水浴鍋中水浴10 min，使未形成芽孢的菌體失活，自然冷卻后利用顯微鏡和血球計數板進行直接計數，計算芽孢量[12-13]。菌體生長量用發酵液的OD600表示，采用紫外分光光度計進行測定[14]。

1.2.2 最佳氮源的篩選 以蛋白胨、尿素、牛肉膏＋酵母粉、牛肉膏＋酵母粉＋蛋白胨、酵母粉＋胰蛋白胨、牛肉膏＋蛋白胨和酵母粉＋蛋白胨替換培養基中的氮源。并于30℃條件下，160 r/min振蕩培養48 h后測定各處理發酵液中的芽孢數和菌體生長量，測定方法同1.2.1。重復3次。

1.2.3 最佳發酵條件篩選 建立溫度、初始pH、接種量、裝液量4因素3水平的正交試驗，設9種組合方式。溫度（A）分別設25，30，35℃共3個梯度；接種量（B）分別設0.1%，0.3%，0.5%共3個梯度；初始pH（C）分別設6，7，8共 3個梯度。在500 mL的三角瓶中，裝液量（D）分別裝入 100，200，300 mL發酵培養液3個處理。于160 r/min條件下發酵培養48 h后，對芽孢數和菌體生長量進行測定。

1.2.4 GZ-5菌株的促生作用測定 將GZ-5菌株在最佳培養條件下發酵培養48 h獲得菌株發酵液，發酵液經12 000 r/min，4℃離心10 min，分別獲得上清液和細菌菌體，并將菌體加入到與發酵液等體積的無菌水中，制成菌懸液。上清液和菌懸液分別稀釋一定的倍數后備用。選取大小長勢基本一致的2～3葉期的番茄幼苗作為試驗對象，分別澆灌原液、5倍、10倍、50倍、100倍的稀釋液，放置人工氣候箱中培養（培養溫度25℃，濕度為70%，光照時間每天16 h），20 d后測定各處理番茄苗的株高、鮮質量和干質量。重復3次。同時以營養液和無菌水為對照。

2 結果與分析

2.1 最佳碳源篩選結果

GZ-5菌株經發酵48 h后，菌體生長量及芽孢量如圖1所示。從圖1可以看出，最適合GZ-5菌株生長的碳源為葡萄糖，其OD600可達2.03，其次為蔗糖、果糖，而淀粉、乳糖、麥芽糖較低；最適合GZ-5菌株產芽孢的碳源為葡萄糖，芽孢生成量為3.87×109cfu/mL，其次為蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、果糖。因此，選擇葡萄糖為促進GZ-5菌株生長的最佳碳源。

2.2 最佳氮源篩選結果

以葡萄糖為碳源篩選適合GZ-5菌株生長的最佳氮源，篩選結果如圖2所示。

由圖2可知，GZ-5菌株在含有不同氮源的培養基中生長量和生成的芽孢量不同，其中，最適合菌株生長的氮源為牛肉膏+蛋白胨，發酵48 h，其發酵液OD600為1.95，其次為蛋白胨＋酵母粉、牛肉膏＋蛋白胨＋酵母粉；而芽孢生成量最多的為牛肉膏＋蛋白胨＋酵母粉，發酵48 h，其發酵液中芽孢量為3.18×109cfu/mL。因此，選擇牛肉膏+蛋白胨+酵母粉為GZ-5菌株的最適氮源。

2.3 最佳發酵條件篩選結果

菌體生長量及芽孢量最適發酵條件測定結果如表1所示。方差分析結果表明（圖3），在不考慮各因素之間的交互作用時最優組合是A2B2C3D1或A2B3C1D2（表1）；在考慮有關因素的交互作用時，通過正交試驗方差分析可以得出，以芽孢量為基準的最優組合為A2B2C2D2（圖3，表2）。由方差分析結果可知，最佳發酵條件是：溫度30℃、接種量0.3%、初始pH7.0、裝液量為500mL三角瓶中裝入200mL。

表1 內生細菌GZ-5發酵條件優化正交試驗結果

表2 最優組合結果

2.4 GZ-5菌株促生作用測定結果

促生測定結果表明，GZ-5菌株發酵液及菌懸液均對番茄幼苗的生長表現出一定的促生作用。從圖4可以看出，GZ-5菌株的發酵液10倍稀釋液處理番茄幼苗20 d后，其株高、鮮質量、干質量分別比對照增加了37.48%，19.98%，35%，且達到了顯著水平，其他處理除發酵原液表現出一定的抑制作用外，均表現出促生。而從圖5可以看出，GZ-5菌株的菌懸液原液處理番茄幼苗20 d后，其株高、鮮質量、干質量分別比對照增加了49.17%，49.45%，49.44%，且達到了顯著水平，其他處理也均表現出促生作用。

3 結論與討論

拮抗菌或其他生防菌發酵條件的優化是菌株投入生產應用的先決條件，碳源、氮源、溫度、pH、接種量、培養時間等都會影響到芽孢桿菌的生物量及芽孢數量。車曉曦等[15]研究結果表明，解淀粉芽孢桿菌SAB-1的最佳發酵條件為：溫度31℃，初始pH 6.0，接種量1%，250 mL三角瓶中裝液量50 mL，180 r/min、發酵培養26 h。權春善等[16]研究發現，解淀粉芽孢桿菌Q-12的最佳發酵條件為溫度33℃、初始pH 6.0、最佳培養時間為40 h。信珊珊等[17]研究得出，解淀粉芽孢桿菌WH1的最佳發酵條件以溶氧量在30%以上、時間為48 h最佳。本研究結果表明，菌株GZ-5的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源是牛肉膏＋酵母粉＋蛋白胨，最適發酵條件為溫度30℃、初始pH 7.0、接種量0.3%、裝液量為500 mL三角瓶中裝入200 mL，在此條件下，發酵培養48 h左右，菌體生物量及芽孢生成量均達到最佳。這與高振峰[18]的研究結果類似。

IDRISS等[19]通過試驗表明，解淀粉芽孢桿菌可通過分泌生長素類似物（IAA）來促進植物的生長。宋永燕等[20]研究LM-3對水稻的促生作用時也發現，低濃度拮抗菌對植物有促生作用，但較高濃度處理卻出現抑制作用。本研究發現，GZ-5發酵液的不同稀釋倍數對番茄幼苗均表現出先增大后下降的趨勢，10倍稀釋液對番茄幼苗的生長最好。這與李哲[21]在小麥上的解淀粉芽孢桿菌FZB42的促生試驗結果相似。本試驗僅通過室內盆栽測定了GZ-5菌株的促生作用，但對于該菌株的田間促生效果和促生機制等還有待于進一步的研究。