P21基因過表達對甲狀腺癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制

翟健，胡萬寧，李軍，石福民

唐山市人民醫院頭頸外科，河北 唐山 0630010

甲狀腺癌是內分泌系統較為常見的一種惡性腫瘤，其發病率逐年增加，約占全身惡性腫瘤的3%，約占頭頸部惡性腫瘤的5%[1]。據報道，全球甲狀腺癌的發病率女性是男性的3.57倍[2]。目前，甲狀腺癌的治療手段主要包括手術治療、內分泌治療和131I治療等，但治療后易出現復發[3]。因此，尋找新的方法改善腫瘤的治療和預后具有重要意義。腫瘤的發生是一個復雜的過程，受多種因素的影響，如癌基因和抑癌基因的異常表達等均可導致細胞的惡性增殖，嚴重威脅人類的生命健康。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclindependent kinase inhibitor 1A，P21）可以抑制周期蛋白依賴性激酶的活性，對細胞周期發揮調控作用。相關研究表明，P21在細胞增殖過程中DNA的損傷、修復過程中發揮重要作用，P21過表達可以使細胞周期停滯在G1、G2或S期[4-5]。目前，關于P21在甲狀腺癌中作用機制的研究相對較少，因此本研究通過過表達P21基因，探討P21基因過表達對甲狀腺癌細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制，旨在為甲狀腺癌的診斷、治療及預后提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺癌細胞系SW579購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）細胞庫，胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、L-15培養基、脂質體Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司，噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）購自上海碧云天生物技術有限公司，膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，P21抗體購自美國BD公司，B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）抗體、Bcl-2相關X蛋白（B cell lymphoma/leukemia-2 associated X protein，BAX）抗體、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細胞培養

將SW579細胞凍存管迅速置于37℃水浴中，不?；蝿邮辜毎M快融化，800 r/min離心5 min，收集細胞，常規培養于含10%FBS和青鏈霉素的L-15培養基中，置于5%CO2、37℃飽和濕度的細胞培養箱中進行培養。采用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1∶3的比例每3～4天傳代1次。

1.3 細胞轉染

取生長狀態良好的對數期SW579細胞，采用0.25%胰蛋白酶消化細胞，采用不含抗生素的L-15培養基重懸細胞，以2×105/孔細胞加入6孔板中，置于CO2孵箱中培養24 h，待細胞覆蓋率為90%～95%時，將細胞分為對照組（未轉染）、PCLneo-HK組（轉染空載體PCLneo-HK）和PCLneo-P21組（轉染真核過表達載體PCLneo-P21）。具體轉染方法：將4 μg PCLneo-HK或PCLneo-P21質粒與10 μl Lipofectamine 2000混合液加入培養板中，在37℃培養箱中培養6 h，然后將培養基更換為含血清與雙抗的培養基，采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測轉染效果。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活力

取SW579細胞，調整細胞濃度至2×103/ml，將細胞接種于96孔板中，按照不同分組（對照組、PCLneo-HK組、PCLneo-P21組）分別處理后置于孵育箱中培養48 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，繼續培養4 h后終止，小心棄去上清液，加入150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻10 min，使結晶物充分溶解，置于酶聯免疫檢測儀上檢測各孔在490 nm處的光密度值（optical density，OD），每組織5個復孔，實驗重復3次，處理組與對照組OD值的比值為細胞的增殖率。

1.5 流式細胞儀分析細胞的凋亡情況

取1×105個SW579細胞接種于6孔板上，按照不同分組（對照組、PCLneo-HK組、PCLneo-P21組）培養48 h后，采用胰蛋白酶消化，離心，收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2次，采用1×binding buffer重懸細胞，在凋亡檢測試劑說明書的指導下每孔加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，振蕩混勻，常溫避光反應10 min，置于流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.6 Western blot檢測細胞中 Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的表達量

收集處理48 h后的對照組、PCLneo-HK組、PCLneo-P21組細胞，PBS清洗2次，加入細胞裂解液，12 000 r/min離心15 min，離心半徑30 cm，保存于-80℃中，Bradford法檢測蛋白濃度。取樣本蛋白與1×蛋白上樣緩沖液充分混合后，在100℃中變性5 min，將提前配置的10%的分離膠和5%的濃縮膠固定于蛋白電泳槽中，每孔加入30 μg蛋白樣品，90 V電泳至染料前沿進入分離膠，將電壓提高至110 V，待溴酚藍到達分離膠的底端時，停止電泳。切去多余凝膠，在轉移緩沖液中將蛋白凝膠轉移至硝酸纖維素膜上，剪去多余部分，置于5～10 ml 5%脫脂牛奶封閉液中常溫作用1 h，TBST緩沖液洗膜2次，加入脫脂牛奶稀釋的一抗，4℃孵育過夜，TBST緩沖液室溫下清洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗，37℃持續振蕩60 min，TBST緩沖液室溫下清洗3次，每次10 min，滴加電化學發光顯色試劑，暗箱中曝光，Image J軟件觀察蛋白的灰度值，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟-件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P21蛋白表達水平的比較

PCLneo-HK組SW579細胞中P21蛋白的相對表達量與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；PCLneo-P21組SW579細胞中P21蛋白的相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（t=6.989，P＜0.01）。（圖1、表1）

圖1 Western blot檢測SW579細胞中P21蛋白的表達水平

表1 不同組別SW579細胞中P21蛋白的表達水平（±s）

表1 不同組別SW579細胞中P21蛋白的表達水平（±s）

組別對照組PCLneo-HK組PCLneo-P21組P21蛋白相對表達量0.335±0.052 0.417±0.063 0.733±0.089

2.2 沉默P21表達對細胞增殖率的影響

PCLneo-HK組SW579細胞的增殖率與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；PCLneo-P21組SW579細胞的增殖率明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=4.596，P＜0.01）。（表2）

表2 不同組別SW579細胞的增殖率（%，x-±s）

2.3 沉默P21表達對細胞凋亡能力的影響

PCLneo-HK組SW579細胞的凋亡率與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；PCLneo-P21組SW579細胞的凋亡率明顯高于對照組，差異有統計學意義（t=7.899，P＜0.01）。（圖2、表3）

圖2 流式細胞儀檢測SW579細胞的凋亡情況

表3 不同組別SW579細胞的凋亡率（%，±s）

表3 不同組別SW579細胞的凋亡率（%，±s）

組別 細胞凋亡率

2.4 沉默P21表達對細胞中Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的影響

PCLneo-HK組SW579細胞中Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的相對表達量與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；PCLneo-P21組SW579細胞中Bcl-2、cyclin D1蛋白的相對表達量均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（t=3.760、4.457，P＜0.01）；PCLneo-P21組SW579細胞中BAX蛋白的相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（t=3.918，P＜0.01）。（圖3、表4）

圖3 Western blot檢測SW579細胞中Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的表達情況

表4 不同組別SW5-79細胞中Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的相對表達量（x±s）

3 討論

基因的穩定性與細胞周期、細胞凋亡之間的相互作用，維持了細胞增殖的有序性，其中基因的穩定性對細胞的增殖調控起到根本作用[6]。G1/S和G2/M轉換期是細胞周期中兩個重要的時期，若G1/S和G2/M兩個關鍵的轉換期失控，則會導致本來應該終止增殖或凋亡的細胞重新進入細胞分裂過程，導致細胞惡性增殖，腫瘤進一步惡化[7]。P21是一個廣譜的細胞周期依賴性激酶抑制劑和細胞周期的負調控因子，可通過阻礙細胞周期G1/S期的轉化，從而抑制細胞的增殖及修復損傷的DNA或錯誤復制的DNA[8]。因此，通常情況下認為P21屬于抑癌基因。相關研究表明，P21的表達水平與腫瘤的分化程度、浸潤深度、臨床分期、淋巴結轉移有關[9]；P21在甲狀腺癌組織中的表達水平低于正常甲狀腺組織[10]。本研究將過表達載體PCLneo-P21轉染至人甲狀腺癌細胞SW579中，結果顯示PCLneo-P21組SW579細胞中P21蛋白的相對表達量明顯高于對照組（P＜0.01）。

細胞周期蛋白（cyclin）及其信號因子可以維持細胞增殖、分裂過程的有序性，對細胞周期的調控起重要作用[11]。cyclin D1是調控細胞周期的關鍵蛋白，其表達水平增加可以縮短細胞從G1期進入S期的時間，從而促進細胞的增殖[12]。相關研究表明，cyclin D1在甲狀腺癌患者腫瘤組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，與甲狀腺癌的預后密切相關[13]。Bcl-2、BAX是調控細胞凋亡的重要基因，已有研究指出，Bcl-2是抗凋亡因子，BAX是促凋亡因子，兩者發生拮抗作用，共同調控腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、遷移等過程[14]。細胞內Bcl-2蛋白和BAX蛋白的表達水平及比例決定著細胞對凋亡因素的敏感性[15]。相關研究表明，甲狀腺癌組織中Bcl-2、BAX蛋白的表達水平均明顯增高，且均能夠參與細胞凋亡相關過程[16]。本研究結果發現，PCLneo-P21組SW579細胞的增殖率明顯低于對照組，凋亡率明顯高于對照組（P＜0.01），表明過表達P21基因可以抑制細胞增殖并促進其凋亡，但其作用機制尚不清楚，因此，本研究通過Western blot檢測過表達P21基因的SW579細胞中凋亡調控相關的cyclin D1、Bcl-2、BAX蛋白的相對表達量，結果發現PCLneo-P21組SW579細胞中BAX蛋白的相對表達量較對照組明顯增加（P＜0.01），cyclin D1、Bcl-2蛋白的相對表達量較對照組明顯降低（P＜0.01），提示過表達P21基因可能是通過調控細胞周期蛋白和凋亡相關因子的表達來發揮作用。

綜上所述，過表達P21基因可以抑制甲狀腺癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，其可能是通過阻止細胞周期的進程，進而抑制cyclin D1蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達，增加BAX蛋白表達水平來實現的。