CD151對結腸癌細胞WNT信號通路的影響機制分析△

劉學剛，劉艷彩，吳春平，李景光，趙嶺嶺，張振亞#

衡水市第四人民醫院1普外科，2病理科，河北 衡水 0530000

結腸癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率一直居高不下。多項研究均證明，在結腸癌的發生與發展中，WNT信號轉導通路發揮了重要的作用[1-2]。WNT信號轉導通路是由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質組成，在調節胚胎發育、細胞轉運及細胞調亡等過程中發揮了顯著作用[3]。腫瘤轉移是導致結腸癌患者病死率較高的主要原因之一[4]，研究表明，CD151在腫瘤的轉移過程中發揮著重要的作用[5]。CD151屬于4次跨膜結構超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）成員之一，是TM4SF中唯一的癌基因，能夠促進細胞的運動，腫瘤的侵襲和轉移，并且能夠通過穩定新生血管的結構，為腫瘤的侵襲及轉移提供必要條件[6]。然而目前CD151與WNT信號通路的關系少見報道。本實驗通過比較裸鼠移植瘤中的人結腸癌細胞HT29、敲除CD151基因的HT29細胞（CD151－-HT29）的β-catenin基因及蛋白的表達變化，探究CD151對結腸癌細胞WNT信號通路的影響機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞

RPMI1640培養基購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶購自上海源葉生物科技有限公司，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，熒光二抗購自廣州華拓生物科技有限公司，β-catenin抗體以及β-actin抗體均購自美國Abcam公司。HT29細胞以及CD151－-HT29細胞均購自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

20只BALB/c-nu/nu雄性裸鼠[購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，SCXK（滬）2012-0002）]，體重（22±2）g，在無菌環境中飼養，裸鼠所用飼料、飲用水、墊料均經過高壓滅菌處理。

1.3 實驗方法及觀察指標

1.3.1 細胞培養 從-80℃冰箱中取出HT29和CD151－-HT29細胞凍存管，放在37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，將解凍好的細胞快速放入事先準備好的裝有10 ml RPMI1640培養基的15 ml離心管中，離心去上清，重新加入5 ml新培養基，用吹打管小心吹打混勻細胞，轉移至100 cm3的細胞培養瓶中，補足培養液，放入細胞培養箱中培養。待細胞培養瓶中的細胞長滿至80%時，即可傳代培養，用于后續實驗。

1.3.2 荷瘤鼠模型的建立 將狀態良好的裸鼠隨機分為兩組，每組10只，分別設為對照組及觀察組，對照組裸鼠注入HT29細胞，觀察組裸鼠注入CD151－-HT29細胞。建模前需要將處于對數生長期的HT29、CD151－-HT29細胞用胰蛋白酶消化，收集細胞，再用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）使細胞重新分散，細胞終濃度為1×107/ml。將準備好的細胞懸液注射入裸鼠腋下，一切操作在無菌環境下進行。1周后可明顯觀察到腫瘤形成，3周后處死裸鼠，取出腫瘤組織，放入-20℃冰箱中保存，備用。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質印跡（Western blot）技術檢測蛋白表達水平采用Western blot技術檢測HT29、CD151－-HT29細胞形成的腫瘤組織中CD151、β-catenin和β-actin蛋白表達情況。具體操作步驟如下：先制備分離膠、濃縮膠，待濃縮膠凝固后，豎直向上拔起齒梳；將計算好體積的蛋白樣品通過移液槍轉入至加樣孔中，開始電泳，待電泳結束后，開始轉膜，再與抗體發生免疫反應，最后放入至電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒中顯色及顯影。將膠片放入凝膠成像系統中拍照，用Quantity One圖像分析軟件分析目標條帶的分子量和光密度值。

1.3.4 免疫組化技術檢測蛋白表達情況 采用免疫組化技術檢測腫瘤組織中Wnt1a蛋白、Oct4蛋白的表達情況。將離體不超過30 min的腫瘤組織置入4%的多聚甲醛中固定24 h，取固定后的腫瘤組織依次經30%、50%、70%、80%及90%的梯度乙醇脫水，每次30 min。再用二甲苯脫乙醇，20 min后放入石蠟中包埋。將制備好的腫瘤組織石蠟切片分別采用100%、95%及80%的乙醇進行脫蠟，放入3%H2O2溶液中孵育5～10 min，以滅活內源性過氧化物酶。使用蒸餾水沖洗，抗原修復，PBS沖洗3次，滴加一抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗3次，二抗孵育20 min后，再用PBS沖洗3次。DAB染色，染到適宜程度時，使用蒸餾水沖洗終止染色，蘇木精染色1 min，1%鹽酸乙醇浸泡30 s，1%氨水乙醇浸泡45 s，再分別用85%、90%及100%梯度乙醇各處理切片1 min，二甲苯透化2次。根據陽性細胞（以出現灰黃色、金黃色或棕黃色顆粒記為陽性細胞）所占比例及染色強度對切片共同評分，即采用雙評分半定量法。根據陽性細胞所占比例，將切片劃分為4個等級：＜25%為1分，25%～49%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分；根據切片的染色強度，將切片劃分為4個等級：基本無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。將兩種評分相加得最終總分，總分≤3分為陰性，總分＞3分則為陽性。分別對腫瘤組織中的Wnt1a蛋白、Oct4蛋白的表達情況進行初步評估。

1.3.5 實時定量聚合酶鏈式反應技術檢測基因表達情況 采用實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術檢測HT29、CD151－-HT29細胞形成的腫瘤組織中β-catenin基因的表達情況。將取出的腫瘤組織勻漿，向其中加入1 ml的TRIzol試劑提取細胞總RNA，反復吹打使細胞從培養瓶壁上完全脫落。將培養瓶中剩余液體全部轉移至EP管中，勻漿，離心取上清轉移至新EP管中，向其中加入0.5 ml異丙醇，混勻后在室溫下放置10 min，離心后可在EP管的底部和側壁上觀察到膠狀沉淀，即為RNA，棄去上清，加入1 ml 75%乙醇對RNA沉淀進行漂洗后離心收集純凈的RNA，室溫下干燥，放于-80℃下保存備用。每20 μl反轉錄體系中加入1 μl的RNA，振蕩搖勻，短暫離心富集RNA，將EP管放入至自動PCR儀中檢測基因表達情況。以βactin作為內參，β-actin上游引物序列為5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物序列為5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'；β-catenin上游引物序列為5'-TTGAAAATCCAGCGTGGACA-3'，下游引物序列為5'-TCGAGTCATTGCATACTGTC-3'。

最終采用2-△△Ct法計算目的基因的表達量。計算公式：△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin，△△Ct=△Ct觀察組-△Ct對照組。2-△△Ct表示觀察組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數，當2-△△Ct＞1時，表明觀察組目的基因水平高于對照組，基因表達上調；當2-△△Ct=1時，表明觀察組目的基因水平等于對照組，基因表達未發生改變；當2-△△Ct＜1時，表明觀察組目的基因水平低于對照組，基因表達下調。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統-計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD151、β-catenin和β-actin蛋白表達情況的比較

采用Western blot技術分別檢測對照組和觀察組裸鼠腫瘤組織中CD151、β-catenin和β-actin蛋白的表達情況，結果顯示對照組裸鼠腫瘤組織中存在明顯的CD151、β-catenin和β-actin蛋白的表達，而觀察組裸鼠腫瘤組織中并不存在CD151蛋白的表達（圖1），證明CD151-荷瘤鼠模型建立成功。在此基礎上，對兩組裸鼠腫瘤組織中的β-catenin相對表達量（與β-actin的比值）進行比較，結果顯示，對照組β-catenin相對表達量為（0.18±0.02），與觀察組的（0.13±0.01）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 Western blot技術檢測兩組裸鼠腫瘤組織中CD151、β-catenin和β-actin蛋白的表達情況

2.2 Wnt1a、Oct4蛋白表達情況的比較

采用免疫組化法分別檢測對照組和觀察組裸鼠腫瘤組織中Wnt1a蛋白、Oct4蛋白的表達情況，結果顯示觀察組裸鼠的腫瘤組織中Wnt1a蛋白、Oct4蛋白表達量均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖2、表1）

圖2 免疫組化法檢測兩組裸鼠腫瘤組織中Wnt1a、Oct4蛋白表達情況（SP染色，×200）

表1 兩-組腫瘤組織中Wnt1a、Oct4蛋白表達情況的比較（x±s）

2.3 β-catenin mRNA相對表達量的比較

采用qRT-PCR技術檢測對照組與觀察組裸鼠腫瘤組織中β-cateninmRNA的表達情況，對照組β-cateninmRNA的表達量為（1.01±0.05），明顯高于觀察組的（0.43±0.04），差異有統計學意義（t=22.188，P＜0.01）。

3 討論

隨著人類社會的發展和生活水平的不斷提高，結腸癌的發病率也在逐年升高，目前臨床上治療結腸癌的主要手段為手術切除腫瘤部位，但是在患者手術前，腫瘤很可能已經發生轉移，因此腫瘤無法得到根除并且復發率高[7-8]。目前，探究腫瘤的發生、發展以及轉移機制已經成為治療結腸癌的熱點問題，如何抑制腫瘤的轉移很可能會成為結腸癌治療的下一個突破口。

眾所周知，腫瘤的轉移機制十分復雜，目前有研究表明，腫瘤的轉移與腫瘤內部微血管的形成有關且與WNT信號通路密切相關[9-10]。WNT信號通路是由一系列癌基因以及抑癌基因編碼表達的蛋白質組成，能夠抑制β-catenin的降解，導致細胞質內的β-catenin增多，引起T細胞因子轉錄水平提高，促進多種靶基因激活，如原癌基因c-Jun、可異位基因c-myc和基質金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）等，這些靶基因在腫瘤的生成、發展以及轉移中發揮了重要作用[11-13]。而CD151蛋白能夠促進腫瘤血管的生成，并且能夠形成CD151-整合素復合體系統維持新生血管的穩定[14-15]。本實驗結果發現，與對照組相比，觀察組裸鼠腫瘤組織中β-catenin蛋白及mRNA表達均有下降，初步推測CD151可能是WNT信號通路的上游基因，對WNT信號通路相關蛋白表達有調控作用。本研究結果還表明，對照組裸鼠腫瘤組織中存在明顯的CD151蛋白表達，而觀察組腫瘤組織中并不存在CD151蛋白的表達，這一結果說明CD151基因缺失的結腸癌荷瘤鼠模型建立成功。采用Western blot技術檢測β-catenin和β-actin蛋白的表達水平，發現觀察組裸鼠腫瘤組織中的β-catenin相對表達量低于對照組，但差異無統計學意義，這可能與樣本量較少有關。當WNT信號通路尚未被激活時，β-catenin蛋白能夠維持細胞上皮的完整性，降低腫瘤轉移成功率，一旦WNT信號通路被激活，β-catenin蛋白在細胞核中大量表達并發生集聚，從而失去維持細胞上皮完整性的功能，并且β-catenin蛋白能夠促進血管內皮生長因子的表達[16-17]。本研究結果同樣發現，對照組裸鼠腫瘤組織中Oct4蛋白表達量高于觀察組。Oct4蛋白在維持干細胞的正常功能以及自我更新中發揮了重要的作用，也是WNT信號通路中的重要成員[18-19]。

腫瘤的發生、發展及轉移之間的機制構成了一個復雜的網絡體系。目前，WNT信號通路的作用機制及相互作用也并未全部詮釋出來，本文從研究CD151與WNT信號通路之間關聯的角度出發，以期能夠揭示結腸癌的發生、發展過程，為臨床上結腸癌的治療尋找新的突破口。