富血小板纖維蛋白在骨再生和創面修復中的應用及機制的研究進展

楊波，王少根

作者單位：安徽醫科大學第三附屬醫院、合肥市濱湖醫院燒傷整形科，安徽 合肥 230051

作為新一代的血小板濃縮物，富血小板纖維蛋白（PRF）在臨床上的應用受到越來越多的關注。與富血小板血漿（PRP）相比，PRF富含大量的生長因子，能夠促進破損組織和表皮的修復，并含有多種炎癥因子，具有抗感染和免疫調節的作用［1］。另外，PRF的制備不需要添加任何抗凝劑，所有成分均來源于自體，避免了倫理學的爭議。其立體的三維結構特點增加了穩定性，適合長期的運用。本文就目前PRF的發展歷史、制備方法、結構特點、基礎研究、存在的問題以及骨再生和創面修復中的臨床應用和可能的機制作一綜述，旨在為PRF在組織修復、創面愈合等領域的應用提供一定的理論支持。

1 PRF的發展歷史

PRP是1984年從人血液中提取出來。PRP釋放生長因子的時間短，不能長期作用于組織修復，存在倫理學爭議，且在體外應用時易破碎，效果不穩定，限制了其在臨床上的進一步應用［2］。

PRF，2000年由法國人首次提出，是繼PRP之后的第二代血小板濃縮品。PRF的制備過程不需要添加抗凝劑等，所有成分均來源于自體，避免了免疫排斥反應和交叉感染的可能。PRF具備由纖維蛋白構成的三維立體網狀結構，利于細胞的遷移和增殖，能夠緩慢且持久的釋放生長因子，進而達到促進創傷愈合的作用［3］。

2006年研究人員提出PRF的變種，即濃縮生長因子（CGF）。與傳統的PRF相比，CGF富含更多的纖維蛋白，而且更加黏稠，形成的凝塊更大，因此具備具有更高的抗張強度、更多的生長因子以及更高的黏合強度［4］。

2 制備方法及結構特點

2.1 制備方法PRF的制備過程主要分為離心和凝集兩個部分，首先取病人靜脈血于干燥的未添加抗凝劑的離心管中，立即將離心管置于離心機中，在離心力的作用下，血液中的紅細胞沉降加快，不同沉降速率的物質分開，進而實現血液的分層，其中最上層呈淡黃色的為貧血小板血漿層，最下層呈紅色的為紅細胞碎片層，而兩者之間即為富含血小板的纖維蛋白凝膠層。鑒于血小板和白細胞主要聚集在紅細胞層和凝膠的交界處，因此在制備PRF時需留取少許的紅細胞層，以防止血小板和白細胞的丟失。最后，使用2層無菌紗布對PRF凝膠進行擠壓，使其成為穩定的膜狀結構供臨床使用［5］。

2.2 PRF的結構特點在顯微鏡觀察下，PRF呈現為三維的立體網絡結構，主要由纖維蛋白構成，中間的纖維蛋白網較為疏松，周圍的較為致密［6］。這種網絡結構具備的特點包括：松散的組織、良好的纖維彈性和大孔隙的網狀結構，使得組織修復和創面愈合必備的因子和物質能夠更好的擴散，進而加速組織愈合的過程。另外，電鏡掃描觀察發現PRF基質中含有黏多糖，黏多糖對小分子肽有很強的親和力，可以支持細胞遷移和促進愈合。

血小板以血小板集合物的形式順著纖維蛋白束聚集。進一步的研究發現在PRF中，血小板和生長因子主要通過化學鍵的形式與纖維蛋白結合，由于化學鍵的斷裂是一個緩慢的過程，因此PRF中的生長因子可以發揮長效的作用［7］。

3 PRF在骨再生和創面修復中的基礎研究

3.1 PRF在骨再生中的基礎研究細胞實驗表明，PRF呈劑量依賴性的刺激骨間質干細胞的增殖和分化［8］。進一步的研究發現PRF促進成骨細胞的增殖的機制可能與提高成骨細胞的蛋白激酶和骨保護素的表達有關［9］。近期的研究顯示PRF不僅可以促進成骨細胞的增殖與分化，還對前真皮角化細胞和前脂肪細胞的增殖具有一定的促進作用。電鏡掃描的結果發現將PRF膜與在成骨細胞培養基共培養后，PRF膜邊緣開始出現礦化現象，且黏附有白細胞，提示PRF誘導成骨細胞的增殖和分化的作用可能與白細胞有關［10］。另外，PRF還被發現可以促進牙髓細胞的增殖和分化［11］。

動物實驗研究顯示PRF可誘導牙周膜前體細胞向成骨細胞分化，其機制可能與上調ERK1/2信號通路有關［12］。并且將牙周膜前體細胞與RPF結合形成復合物，可用于大鼠顱骨的缺損修復［12］。研究人員將PRF與種植材料聯合應用，進一步驗證了PRF具有促進骨愈合的作用。自體骨聯合PRF的實驗組在犬行雙側上頜竇底提升術中的效果顯著優于單獨用自體骨的對照組［13］。在PRF聯合蠶絲蛋白修復即刻種植骨缺損的實驗中，與空白對照組相比，實驗組的種植體抗拉伸力顯著提高。另外，研究人員將PRF與羥基磷灰石生物陶瓷植入兔拔牙窩內，與單獨的磷灰石生物陶瓷組相比，PRF組拔牙窩內的組織愈合快，新生骨組織數量較多且質量較好［14］。Lee的研究將PRF聯合蠶絲蛋白修復顱骨缺損的修復中，結果發現實驗組骨缺損愈合速度顯著快于空白對照組［15］。長骨的骨折治療周期長一直是臨床比較棘手的問題，通常使用愈合促進劑來加速愈合的過程。研究人員評估了PRF作為長骨骨折愈合促進劑的可能，經過4周的PRF治療，開放性股骨骨折得到了較好的修復，且X線檢測結果顯示PRF增加了骨組織形成量［16］。另外有研究報道PRF對脛骨骨缺損同樣存在積極的愈合作用［17］，以上研究共同提示PRF可能成為長骨骨折愈合過程中的有效生物材料。

3.2 PRF在創面修復中的基礎研究徐海燕等［18］的研究將凍干的PRF顆粒應用于小鼠背部全層皮膚缺損的修復中，結果顯示，與空白缺損組和上市產品AD甲殼素相比，凍干PRF顆粒組創面肉芽組織形成時間早，創面收縮率明顯，形態學觀察顯示凍干PRF顆粒組創面纖維組織增生活躍，毛細血管和成纖維細胞數量顯著多于對照組，提示PRF不僅可以促進創面愈合，還能夠提高愈合的質量。同樣的研究結果在PRF治療兔耳皮膚創面的試驗中得到進一步證實［19］。

PRF還被應用于糖尿病所致的潰瘍創面修復中。汪新偉等［20］的研究以糖尿病兔潰瘍創面為模型，觀察創面局部使用PRF的療效，結果發現相比于模型組，PRF組創面預后良好，大量肉芽組織形成，表皮層結果修復，大量新生血管形成，成纖維細胞形成聚集，其中的機制可能與PRF促進血管內皮生長因子（VEGF）的表達有關。Chiaravalloti等［21］以糖尿病裸鼠作為研究對象，與常規敷料組相比，經過14 d的PRF處理，小鼠背部皮膚傷口愈合加快，形態學觀察提示其中的機制可能與增加血管形成有關。

近期的一項研究顯示PRF對于腸道創面同樣存在修復作用。研究人員通過腸系膜缺血/再灌注損傷構建了大鼠腸道損傷模型，在使用PRF后，顯著降低了腸道局部并發癥，組織學結果顯示所有使用了PRF的大鼠腸道近乎完全愈合［22］。

4 PRF在骨再生和創面修復中的臨床應用

4.1 PRF在骨再生中的作用PRF具有一定的成骨能力，其機制可能與其長期且緩慢釋放生長因子和基質蛋白，并促進間充質細胞轉換為成骨細胞有關。因此，可將PRF作為牙周骨缺損治療的填充劑。與動物實驗一致的是，臨床研究也顯示單獨使用或者與人工材料合用時對牙周骨具有良好的治療效果。有報道表明PRF單獨使用時可改善牙齒深度、附著水平和骨密度等方面用于牙周骨缺損的治療［23］。將PRF分別與合成材料OSSIFITM和羥基磷灰石顆粒形成混合物，觀察對牙周骨缺損的效果，組織學觀察結果均觀察到了良好的骨結構［24-25］。因此，PRF與自體骨的聯合使用不僅增加了成骨的比率同時也提高了新骨頭形成的質量［26］。

大量的研究探討了PRF在上頜竇底提升術中的應用。Choukroun等［27］在上頜竇側壁開窗式竇底提升術中，聯合PRF與凍干骨異體移植物作為充填材料減少了在種植體植入前的愈合時間。Mazor等［28］進行上頜竇底提升術時將PRF作為移植材料與種植體同時植入，治療6個月后，放射學結果顯示在上頜竇底的下方一直到種植體的尖端部分有大量的骨質形成，組織學觀察顯示了良好的骨結構和骨活力。Meyer等［29］首次將β-磷酸三鈣聯合自體生長因子（內含PRF）應用到上頜竇提升手術中，結果發現，單用β-磷酸三鈣聯合自體生長因子而不使用骨移植材料，可以顯著減少并發癥的發生。以上研究提示PRF可能成為一種具有在上頜竇黏膜和骨質上愈合性質的生物材料。

顱底手術導致的骨缺損重建一直是臨床面臨的一個問題，近期的一項研究評估了PRF對顱底手術部位缺損處的骨再生作用［30］。CT掃描的結果顯示骨缺損部位被產生的新骨所閉合，表明PRF具有誘發顱底手術部位缺損處的骨愈合與再生的可能。

4.2 PRF在創面修復中的應用鑒于PRF可以持續且穩定的釋放生長因子，其已在創面修復中得到了廣泛的應用。近期的一項研究比較了PRP與PRF在面部脂肪移植手術中作用，通過比較手術后的攝影視圖，疼痛，水腫和瘀傷情況來評手術的效果，結果發現PRF更適合于面部脂肪移植手術［31］。另外，一系列的研究將PRF應用于面部多個部位的整形手術中，并且取得了良好的效果［32-33］，其發揮作用可能與以下幾個方面有關：①PRF包含的血小板具有止血的作用，可減少術后的淤血；②PRF能夠調節炎癥免疫反應，可減少術后的水腫和疤痕形成；③PRF能夠促進膠原蛋白的合成，可減少術后的疤痕形成；④PRF能夠促進血管生成，可減少術后皺紋的形成。

目前，PRF在燒傷導致的創面修復中也有研究報道。黎君君等［34］的研究顯示PRF可用于治療兒童面部Ⅱ度燒傷。由于兒童在診治過程中配合度低，家屬對創面愈合要求高，因此，提高創面愈合的速度和質量成為燒傷科亟待解決的問題。PRF的網狀纖維蛋白結構與天然的組織結果類似，有利于細胞的移動過程，進而增加了燒傷創面的愈合過程。與單用等滲鹽水紗布覆蓋半暴露的對照組相比，PRF聯合殼聚糖創面修復膜凝膠治療不僅提高了創面的愈合率，同時也縮短了愈合的時間，減少了疤痕指數，值得在燒傷科推廣使用。

另外，近期的研究顯示PRF對各種疾病所致的潰瘍面均具有一定的修復作用。由漢森病導致的不愈合性營養性潰瘍是導致病人殘疾的主要原因之一，研究人員探討了PRF在此種疾病中的治療作用，結果發現7名受試者的93.52%的潰瘍面得到了較好的改善，且無不良反應的報告產生，因此，PRF治療漢森病病人的營養性潰瘍被認為是一種可行、安全、簡單且廉價的方法［35］。另一項隨機對照研究探究了PRF對治療靜脈性腿潰瘍面的治療作用，結果發現經過4周的PRF治療病人的潰瘍面減少了85.51%，接近是生理鹽水對照組的兩倍［36］。Londahl等［37］的研究將leucopatch（一種PRF的類似物）運用于糖尿病足所致的潰瘍創面的修復中，結果發現73%的病人在20周內潰瘍面到達愈合。國內學者探討了PRF在骨折術后深部組織及內置物外露創面中覆蓋創面的臨床療效，結果發現11例創面均愈合良好，且原骨折部位骨痂形成良好或骨折已愈合，避免了病人二次手術的風險［38］。鄭麗君等［39］改進了PRF的制備方法，制備出微泵法富血小板纖維蛋白基質（PRFM），并在感染性潰瘍、靜脈淤血性潰瘍、創傷性潰瘍和糖尿病性潰瘍創面修復中均取得了良好的效果。

5 PRF的作用機制

PRF主要是由纖維蛋白基質和細胞（血小板、白細胞）等共同構成的。機制研究發現PRF發揮促進創面和骨組織愈合的作用可能通過血小板生長因子、白細胞因子和纖維蛋白基質的共同調節。

5.1 PRF促進骨再生的機制大量的研究顯示PRF促進骨再生的機制可能與堿性磷酸酶（AKP）活性［40］、骨保護蛋白（OPG）［41］、骨形態發生蛋白（BMP）［42］和核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）［43］的表達密切相關。研究發現將PRF填充于骨缺損的區域，AKP的活性逐漸增高，在第14天達到峰值且礦化的程度也達到最大［43］。另有報道顯示將PRF與人成骨樣細胞MG-63共培養時，細胞內OPG和RANKL蛋白的表達均顯著升高，提示PRF具有抑制破骨細胞活化的作用［44］。另外，BMP被發現在PRF發揮促進骨再生的機制發揮一定的作用。研究發現PRF可緩慢的釋放BMP，進一步的研究發現BMP聯合TGFβ可促進間質干細胞分化為成骨細胞和軟骨細胞，增加骨細胞中AKP的活性，上調骨鈣蛋白的表達，提高成骨細胞的活性［45］。

5.2 PRF促進傷口愈合的機制當PRF中含有的血小板被激活時，會釋放大量的血小板源性生長因子（PDGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子（ECG）、胰島素樣生長因子（IGF-1）、轉化生長因子（TGF）和成纖維細胞生長因子（FGF）等［46］。創面局部的新生血管的形成是創面能否愈合的關鍵環節。VEGF被認為在促進新生血管和肉芽組織的形成過程中發揮著重要的作用，其機制可能與VEGF調控血管內皮細胞的增殖與分化，增加血管內皮細胞的通透性有關［47］；研究表明，PDGF具有促進血管內皮細胞和平滑肌細胞的遷移和增殖的作用，進而加快局部血管的重建［48］；動物實驗發現皮下注射TGFβ可以增強新生鼠血管的形成，進一步的研究發現，TGF可能通過Smad蛋白直接調控VEGF和PDGF來發揮促血管形成的作用［49］。

PRF中含有的白細胞及其分泌的免疫因子可增加創面局部抗感染的能力，加快受損組織的愈合速度。近期的研究證實當PRF中的白細胞被局部炎癥因子激活時，可有效的抑制局部炎癥反應，對抗創面的感染［50］。另外，由單核巨噬細胞分泌的白介素-1β（IL-1β）被認為在炎癥反應初期可以聚集白細胞，達到改善局部炎癥的過程［51］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在炎癥反應和抗感染等方面發揮著重要的作用，與相應的受體結合后，可調控NF-κB信號通路，誘導IL-6的產生，進而介導炎癥反應［52］。

此外，由于PRF具備的獨特的立體三維結構，PRF可以緩慢且持續的分泌各類生長因子和細胞因子，在整個創面修復的過程中均可發揮調控作用。

6 PRF的應用優勢及存在的問題

6.1 PRF的應用優勢特點與PRP相比，PRF的應用優勢可概況為5個方面：（1）首先，與PRP相比，PRF最顯著的優勢在使用安全性上，由于PRP在制備過程中需要添加異種來源的凝血酶和抗凝血制品，可能導致免疫排斥反應的發生和感染性疾病的傳播，而PRF所有成分均來自自體，不需要加抗凝劑，無倫理道德爭議及血液交叉感染風險；（2）與PRP相比，PRF能夠緩慢且持久的釋放生長因子，更加有效地促進脂肪間充質干細胞（ADSCs）的分化與增值，明顯改善對破損組織的修復效果；（3）PRP中添加了高濃度的牛凝血酶形成了致密的PRP膜，不利于細胞因子的滯留和細胞的遷移，而PRF中未添加外源性的凝血酶，自身含有的凝血酶濃度較低，進而形成了柔韌多孔的PRF膜，有利于細胞因子的滯留和骨髓干細胞的遷移；（4）PRP為四分子結構，而PRF經過自然聚合過程，形成的纖維蛋白主要為三分子立體網狀結構，使得PRF更加堅實穩定；（5）PRP的制備過程尚未標準化，最有效的濃度和局部環境有待進一步研究，且制備過程需加入異種凝血酶和抗凝血制品，使得制備過程繁瑣，需要占用較多的時間，而PRF的制備過程較為簡單且操作容易；（6）目前PRP在臨床上很少單獨使用，需要其他材料聯合應用，且主要發揮的是輔助作用，而PRF是具有彈性質韌的半透明膜結構，可作為自體源性生物材料應用于臨床，如植骨手術中。

6.2 PRF臨床應用存在的問題目前限制PRF在臨床廣泛應用的主要問題是PRF的保存時間短，制取后需立即使用。因此，延長PRF的保存時間成為近期研究人員關注的熱點之一。有研究顯示通過真空低溫冷凍干燥法獲取的凍干PRF能夠保留PRF的活性，使得PRF能夠長期冷藏，使用簡便和靈活［53］，但經過超低溫冷凍保存前后的PRF的生物學作用是否存在差異還需進一步大量的臨床實踐予以確認。

另外，由于PRF的制備過程中未加入抗凝劑，因此采血及離心的速度必須快，否則會導致制備的失敗，不能形成大塊的纖維蛋白網。

PRF的臨床研究報道多為病例報告和小樣本的對照研究，缺乏多中心的、大樣本量的隨機對照研究，無統一的實驗標準，使得目前的臨床研究結果缺乏說服性和可比性。

7 展望

作為第二代自體血小板濃縮物，PRF具備明顯的優點有：包括避免了過敏反應、免疫排斥、交叉感染以及倫理道德等問題、制備過程極為簡單，無需添加任何抗凝劑和凝膠劑，成本低廉。目前PRF的制備方法已經十分成熟，法國尼斯公司已開發出一套專門用于制備PRF的器械，為標準化制備PRF提供了方便。由于PRF的結構特點和組成成分，PRF可作為自體生物填充材料，廣泛的應用于與組織修復、創面愈合等相關臨床醫學領域。