1株紅樹林可口革囊星蟲共附生放線菌抑制COX-2活性成分的研究

葉子聰，覃翠穎，陳鋼，溫露

(廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006)

COX-2抑制劑(如羅非昔布、尼美舒利等)作為目前臨床廣泛使用的非甾體抗炎藥之一，是通過抑制炎癥反應過程中產生的大量COX-2使花生四烯酸轉化速度減慢，導致前列腺素的合成減少，從而達到抗炎效果[1-2]。目前，市售的非甾體抗炎藥在長期服用后會引起腸胃及腎臟等藥物不良反應[3]，因此開發新的COX-2抑制劑對于炎癥治療具有重要意義。

自20世紀60年代起，從海洋微生物中發現結構新穎、生物活性多樣的先導化合物已成為研究熱點[4]。海洋微生物與海洋動植物存在共附生、寄生等多種相互關系，不僅能從宿主汲取營養物質，還能產生一些生物活性物質來協助宿主防止病原體侵害，與宿主互利共生，是海洋新型生物活性物質的主要生產者[5]。目前，已發現的微生物來源天然產物中約50%來自放線菌[6]。紅樹林分布于熱帶和亞熱帶海岸潮間帶，是陸地向海洋過渡帶上的特殊生態環境。在適應生態環境與自我保護的同時，通過其特殊的代謝途徑產生各種生物活性物質。從紅樹林微生物中發現具有生物活性的先導化合物也已成為天然產物研究領域的熱點[7]。

可口革囊星蟲(Phascolosomaesculenta)，俗稱泥丁、海丁、土筍等，廣泛分布于我國廣東、廣西和福建等沿海地帶，是我國紅樹林大型無脊椎動物之一。國內外對可口革囊星蟲主要在形態學、繁殖發育、蟲體和多糖的成分等方面進行研究[8]，但對其共附生微生物的研究未見報道。本文首次對紅樹林可口革囊星蟲共附生放線菌進行分離，通過ISP2液體培養基進行發酵，發酵液經乙酸乙酯萃取得到發酵產物，對發酵產物進行抑制COX-2活性考察，并對其中1株高活性菌株PE05的次級代謝產物進行分離純化，從中發現具有抗炎活性潛力的物質。

1 儀器與材料

1.1 菌株來源

實驗菌株從廣東省湛江市國家自然保護區的可口革囊星蟲表皮分離得到。活性菌株PE05在改良高氏Ⅰ號培養基上菌落小，起初呈白色，發育一段時間后變黃，呈絨狀，參考《伯杰細菌鑒定手冊》[9]、《鏈霉菌鑒定手冊》[10]，結合形態特征、培養特征，初步確定該菌為鏈霉菌屬，以改良高氏Ⅰ號斜面保存管于4 ℃條件下保存于廣東藥科大學藥學院。

1.2 儀器與試劑

YM75立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申醫療器械有限公司)；TOP-870數控超凈工作臺(廣潔凈化設備有限公司)；TCYQ搖床(太倉市實驗設備廠)；TDL-5A臺式低速大容量離心機(常州市凱航儀器有限公司)；COX抑制劑篩選試劑盒(美國Cayman Chemical公司)；FC酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；SPX-250C恒溫恒濕培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；Bruker 400 MHz核磁共振儀(德國Bruker公司)；四級桿飛行時間質譜儀Q-Tof Micro(美國Waters公司)；X-4數字顯示顯微熔點儀(北京泰克儀器有限公司)。

乙酸乙酯、石油醚、甲醇(廣東光華科技股份有限公司)；GF254薄層層析硅膠和200～300目柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(瑞典Ge Healthcare Bio-Sciences AB公司)。

1.3 培養基

改良髙氏Ⅰ號培養基：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 20.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2，K2Cr2O7100 μg/mL。

ISP2液體培養基：麥芽提取物10.0 g，葡萄糖4.0 g，酵母浸粉 4.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2。

2 方法

2.1 共附生放線菌的分離純化

取新鮮可口革囊星蟲樣品，用無菌棉棒輕輕擦拭表面泥層，在無菌條件下取其表皮并剪碎，在盛有無菌水的三角瓶中振蕩后靜置，取上清液。將樣品上清液制備成10-1～10-4倍不同稀釋度的菌懸液，各取100 μL分別涂布于改良高氏Ⅰ號培養基中，于28 ℃、濕度為80%的恒溫恒濕培養箱中培養。待長出菌落后，根據菌落的形態差異，將不同的菌落接種至新的改良高氏Ⅰ號培養基中培養，反復操作直至獲得單一菌落。將純化過后的放線菌接種至改良的高氏Ⅰ號斜面培養基，于4 ℃冰箱中保存。

2.2 共附生放線菌的微量發酵

將11株可口革囊星蟲共附生放線菌斜面保存管從冰箱中取出，放至室溫，分別將菌株接種于改良高氏Ⅰ號固體培養基上，28 ℃培養3 d后，待長至對數期，接種至ISP2液體培養基(250 mL/三角瓶，共1 L)中，以120 r/min、28 ℃下搖床培養10 d。將發酵液置于55 ℃水浴鍋中濃縮。濃縮后3 500 r/min離心20 min，取上清液，上清液用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，減壓濃縮，分別得到該菌株發酵液的發酵產物。

2.3 COX-2抑制活性的測定

分別將11株菌的發酵產物浸膏用1%DMSO水溶液配制成質量濃度為20 mg/mL的溶液，按照試劑盒說明書進行實驗。并用酶標儀于波長405 nm處測其吸光值(A值)，以測定反應體系中PGF2α的生成量。根據試劑盒的計算公式，抑制率=(全活性組的平均PG值-給藥組的平均PG值)/(全活性組的平均PG值-背景組的平均PG值)×100%，得到樣品對COX-2 抑制活性百分率(%)。

2.4 活性菌株的發酵

選用ISP2液體培養基對活性菌株PE05進行大量發酵：在無菌條件下，將菌株PE05接至改良高氏Ⅰ號培養基上進行活化，于28 ℃培養3 d，然后接種至10個含有250 mL ISP2液體培養基的三角瓶中，28 ℃、120 r/min搖床培養2 d至長出菌絲體作為大量發酵的種子培養液。配制ISP2培養基100 L，分裝于400個500 mL三角瓶中，每瓶250 mL，高壓滅菌。每瓶接入1 mL種子液，搖床培養10 d。

2.5 代謝產物的提取與分離純化

將100 L發酵液置于55 ℃水浴鍋中濃縮至10 L，將濃縮液以3 500 r/min離心20 min，得到上清液。用等體積的乙酸乙酯萃取至有機層無色，減壓濃縮得發酵液粗提物浸膏30.0 g。

浸膏經硅膠柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯(體積比分別為90∶10、70∶30、50∶50、30∶70和0∶100)、乙酸乙酯-甲醇(體積比分別為100∶1、50∶50、0∶100)進行梯度洗脫，得到25個組分Fr1-25。Fr5經硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯，體積比80∶20)進一步純化，得到2個組分(Fr5-1和Fr5-2)。Fr5-1經Sephadex LH-20(三氯甲烷-甲醇，體積比50∶50)進一步純化得到化合物3(8 mg)。Fr11經硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯，體積比90∶10)進一步純化，得到Fr11-1經Sephadex LH-20(三氯甲烷-甲醇，體積比50∶50)進一步純化得到化合物1(3 mg)。Fr12經硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯，體積比70∶30)進一步純化，得到4個組分(Fr12-1～Fr12-4)。Fr12-1經甲醇重結晶得到化合物4(10 mg)。Fr12-4經Sephadex LH-20(甲醇)進一步純化得到化合物2(3 mg)。Fr15經硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯，體積比55∶45)進一步純化，得到3個組分(Fr15-1～Fr15-3)。Fr15-1經Sephadex LH-20(甲醇)進一步純化得到化合物5(8 mg)。

3 結果

3.1 COX-2抑制活性篩選結果

通過COX抑制活性試劑盒對分離所得11株共附生放線菌，經ISP2液體培養基發酵、乙酸乙酯提取后得到發酵產物，對各發酵產物進行COX-2抑制活性篩選，結果顯示有6株菌的發酵產物對COX-2具有一定的抑制活性，占所分離菌株總數的54.5%(見表1)，其中PE05發酵產物的抑制率高達92.75%。

表1 紅樹林可口革囊星蟲共附生放線菌發酵產物的COX-2抑制作用

Table1COX-2 inhibitory activities of the fermentation products from symbiotic actinomycetes.

菌株編號COX-2抑制率/%菌株編號COX-2抑制率/%PE0255.43PE0673.02PE0484.24PE0983.11PE0592.75PE1075.78

3.2 結構鑒定

化合物1：黃色固體，易溶于丙酮，mp 207～209 ℃。ESI-MS(m/z)：167[M-H]-，分子式為C8H8O4。1H NMR(400 MHz,Acetone-d6)δ：3.90(3H，s，4-OCH3)，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.55(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.58(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6)。13C NMR(100 MHz,Acetone-d6)δ：122.0(C-1)，114.6(C-2)，147.2(C-3)，151.1(C-4)，112.6(C-5)，123.9(C-6)，166.6(C-7)，55.4(4-OCH3)。以上數據與文獻[11]報道一致，故鑒定化合物1為香草酸(vanillic acid)。

化合物2：白色固體，易溶于丙酮，mp 210～212 ℃。ESI-MS(m/z)：137.1[M-H]-，分子式為C7H6O3。1H NMR(400 MHz,Acetone-d6)δ：7.92(1H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，6.92(1H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)。13C NMR(100 MHz,Acetone-d6)δ：167.5(—COOH)，122.7(C-1′)，162.6(C-4′)，132.7(C-3′，C-5′)，116.0(C-2′，C-6′)。以上數據與文獻[12]報道一致，故鑒定化合物2為對羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoie acid)。

化合物3：白色晶體，易溶于三氯甲烷，mp 76～78 ℃。ESI-MS(m/z)：135.0[M-H]-，分子式為C8H8O2。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ：10.70(1H，s，COOH)，7.32-7.41(5H，m，H-2′，3′，4′，5′，6′)，3.70(2H，s，H-2)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：178.3(—COOH)，133.4(C-1′)，129.5(C-2′，6′)，128.8(C-3′，5′)，127.5(C-4′)，41.2(C-2)。以上數據與文獻[13]報道一致，故鑒定化合物3為苯乙酸(phenylethyl acid)。

化合物4：白色固體，易溶于甲醇，mp 235～237 ℃。ESI-MS(m/z)：124.0[M+H]+，分子式為C6H5NO2。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：13.39(1H，s，—COOH)，9.07(1H，d，J=2.2 Hz，H-2)，8.79(1H，dd，J=2.0，4.8 Hz，H-6)，8.26(1H，dt，J=4.0，8.0 Hz，H-4)，7.54(1H ，ddd，J=4.0，8.0，12.0 Hz，H-5)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ：166.2(—COOH)，153.3(C-2)，126.6(C-3)，136.9(C-4)，123.8(C-5)，150.2(C-6)。以上數據與文獻[14]報道一致，故鑒定化合物4為煙酸(nicotinic acid)。

化合物5：白色晶體，易溶于三氯甲烷，mp 154～156 ℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：6.40(1H，s，NH)，4.11(1H，t，J=8.0 Hz，H-6)，4.00(1H，dd，J=4.0，8.0 Hz，H-9)，3.56(2H，m，H-3a，3b)，2.34(1H，m，H-5a)，2.12(1H，m，H-5b)，2.01(2H，m，H-4a，10a)，1.89(1H，m，H-4b)，1.77(1H，m，H-11)，1.52(1H，m，H-10b)，0.99(3H，d，J=4.0 Hz，H-12)，0.94(3H，d，J=4.0 Hz，H-13)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：170.7(C-1)，166.4(C-7)，59.1(C-6)，53.6(C-9)，45.6(C-3)，38.7(C-10)，28.2(C-5)，24.8(C-11)，23.4(C-12)，22.9(C-4)，21.4(C-13)。以上數據與文獻[15]報道一致，故鑒定化合物5為環(脯-亮)二肽[cyclo-(Pro-Leu)]。

4 結論

本文首次從廣東湛江紅樹林可口革囊星蟲表皮中分離得到11株共附生放線菌，并對其發酵產物進行抑制COX-2活性的考察，結果表明有6株菌的發酵產物對COX-2具有不同程度的抑制作用，其中PE05的抑制率達到92.75%。為進一步確定菌株PE05的抑制COX-2活性成分，對該菌株的發酵產物進行分離純化得到5個化合物，經結構鑒定確定為香草酸、對羥基苯甲酸、苯乙酸、煙酸、環(脯-亮)二肽。目前，已有研究表明香草酸具有一定的抗炎活性[16]，其余4個化合物尚未有文獻報道過其抗炎活性，今后將進一步探究4個化合物的抑制COX-2活性，為發現新型COX-2抑制劑奠定基礎。