印度黃檀化學成分分離及結構鑒定

李然，徐長瓊，祁龍凱，李靜，黎春輝，蔡聰，葉耀祥，林勵

(1.岳陽市中醫醫院，湖南 岳陽 414000； 2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006； 3.廣東省湛江南藥試驗場，廣東 遂溪 524338； 4.廣東中檀實業有限公司，廣東 臺山 529200； 5.汕頭大學醫學院，廣東 汕頭 515041)

降香來源于降香檀，具有理氣、活血化瘀、止痛止血的功效[1]。但降香檀資源因過度開采已面臨瀕危[2-3]，而人工栽培需要10年才初步結香，30年才能成材，無法滿足市場需求。

印度黃檀DalbergiasissooRoxb.為豆科黃檀屬(Dalbergia) 落葉半落葉大喬木，原產于印度、尼泊爾、巴基斯坦、孟加拉國、巴西、馬達加斯加等國[4]。印度黃檀為中藥降香原植物降香檀D.odorifera同屬植物，其心材曾進口作為降香藥材使用，即《本草綱目》木部·降真香所載“俗呼舶上來者為番降”中的番降，具有化瘀止血、理氣止痛之功效[5]。該植物生長迅速，種植5年生就能形成心材，10～15年基本成材[6]，有望緩解降香檀資源緊張的局勢。

印度黃檀心材主要含揮發油和黃酮類成分[7-8]，具有舒張血管、降血壓、降血脂、抗凝血、抗腫瘤、抗氧化、抗感染鎮痛及抑制破骨細胞功能下降等藥理活性[9-12]。黃酮類成分中黃檀素(黃檀內酯)具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化[13]等生物活性，對離體兔心有顯著增加冠脈流量、減慢心率、輕度增加心跳幅度的作用[14]，對兔血漿有微弱的抗凝作用[15]；4-甲氧基黃檀醌則表現出顯著的抗感染活性及抗骨肉瘤作用[16-17]。

化學成分是植物藥安全、有效、質量評價的物質基礎。迄今為止未見專門對印度黃檀心材主要化學成分研究的報道。本課題對國內引種印度黃檀的乙醇提取液進行萃取，得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇部位，對石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位運用柱層析法、萃取法、溶劑法、結晶法等進行分離提純，得到化合物單體。通過波譜數據分析，并參考各類文獻資料，對化合物的結構進行鑒定。為印度黃檀質量標準的建立及資源開發提供科學依據。

1 儀器、材料與試藥

1.1 儀器

DRX-500型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；E2695型高效液相色譜儀(2998檢測器，Empower3軟件，美國Waters公司)；Waters Symmetry ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；HPLC-QQQ-MS/MS高效液相串聯質譜儀(Agilent公司，6410A)；Agilent HPLC 1290 系統；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(1.8 μm,2.1 mm× 100 mm)；BP 211D型電子分析天平(十萬分之一，瑞士Sartorious公司)；XS 225A型電子分析天平(萬分之一，瑞士Precisa公司)；Milli-Q Reference超純水系統(德國默克密理博公司)； WHF-203B 暗箱式三用紫外分析儀(上海精科實業有限公司)；柱層析硅膠(80～100目，青島海洋化工廠分廠，批號：0100634)；反相硅膠C18(25～40 μm，Merk公司)；GF254薄層層析硅膠預制板(青島海洋化工廠)；博世GHO 10-82電刨[博世電動工具(中國)有限公司]；TC-15恒溫電熱套(1 500 W，海寧市新華醫療器械廠)；KQ500型超聲波清洗器(功率500 W，頻率40 kHz，昆山超聲儀器有限公司)；EYELA N-1000旋轉蒸發儀(日本EYELA公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱(功率600 W，上海精宏實驗設備有限公司)；圓底燒瓶(10 L，廣州藍方化玻儀器有限公司)。

1.2 材料與試藥

實驗藥材印度黃檀于2014年12月采自廣東省湛江市遂溪南藥試驗場，樹齡40年，經廣州中醫藥大學中藥學院實驗中心林勵研究員鑒定為豆科植物印度黃檀(DalbergiasissooRoxb.)的心材。標本保存于廣州中醫藥大學中藥學院實驗中心。

乙醇(EtOH)、環己烷(CYH)、乙酸乙酯(EtOAc)、乙酸(HAc)、甲醇(MeOH)、石油醚(PE)、三氯甲烷(CHCl3)、正丁醇(n-BuOH)等均為西隴化工有限公司分析純產品。提取用乙醇為工業級，甲醇(默克)、乙腈(默克)、H3PO4為色譜純，超純水為自制。

TLC顯色劑：10%(體積分數，下同)H2SO4乙醇溶液、1%(質量濃度，下同)AlCl3乙醇液、碘蒸氣等。

2 實驗方法

取印度黃檀心材1 000 g，刨成薄片后粉碎并過2號篩，提取溶劑為85%(體積分數，下同)乙醇，料液比為1∶4，加熱回流提取3次，每次120 min。趁熱濾過，合并濾液，放置12 h，取上清液，減壓濃縮成稀浸膏狀。依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取上述所得稀浸膏，萃取液與稀浸膏的比例為2∶1。分別減壓回收各萃取液溶劑，得各提取部位浸膏，待用。分別得到石油醚(油狀)、三氯甲烷(稠浸膏)、乙酸乙酯(稠浸膏)、正丁醇(稠浸膏)部位18.20、46.20、47.80、35.30 g，使用TLC和HPLC法分析印度黃檀醇提液及各部位化學成分，見圖1。可見正丁醇部位中各成分質量分數較低，主要化學成分集中在石油醚部位、三氯甲烷部位和乙酸乙酯部位，故重點對石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯部位進行成分分離。

2.1 HPLC檢測條件

色譜柱為Waters Symmetry ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.2%(體積分數，下同)H3PO4水溶液，梯度洗脫，程序見表1；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；檢測波長：0～15 min為280 nm，15～22 min為260 nm，22～27 min為350 nm，27～30 min為260 nm，30～52 min為293 nm。印度黃檀不同提取部位及醇提液的HPLC色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.501.000.500.00AU0.500.400.300.200.100.00AU0.300.200.100.000.0150.0100.0050.0000.300.200.100.00AUAUAU10152025303540455005t/minABCDE

A.石油醚部位； B.三氯甲烷部位； C.乙酸乙酯部位； D.正丁醇部位； E.印度黃檀醇提液。

圖1印度黃檀不同提取部位及醇提液的HPLC色譜圖

Figure1HPLC chromatograms of different extraction parts and alcohol extract ofDalbergiasissooRoxb.

2.2 色譜柱填裝

2.2.1 硅膠柱 取80～100目硅膠適量，干法裝柱，用真空泵抽氣0.5 h，使裝填物致密，將拌樣后的硅膠均勻加入層析柱中備用，上端覆蓋少許石英砂，最上端加1團脫脂棉以免加液時沖起裝填物。

2.2.2 C18反相硅膠柱 取反相硅膠適量，干法裝柱，上端塞1團棉花，以免加液時沖起硅膠。先用甲醇沖洗2～3個柱體積，再用10%(體積分數，下同)甲醇-水系統平衡反相硅膠柱，待用。

2.3 石油醚部位成分分離

2.3.1 梯度洗脫初步分離 將石油醚部位浸膏用少量乙酸乙酯溶解后加入一定量硅膠(80～100目)拌樣，揮干溶劑，充分研磨，以硅膠柱進行柱層析，依次用環己烷-乙酸乙酯(體積比100∶0～100∶10)進行梯度洗脫，每份收集洗脫液約100 mL，共收集48份，經TLC 檢識，合并相同組分。

2.3.2 收集、檢識、合并及純化 分別用不同展開劑展開所收集到的流分，用1% AlCl3溶液顯色，相同組分合并，減壓濃縮。將第18～38流分合并，用少量甲醇溶解，并用環己烷萃取，取上層環己烷層，減壓回收溶劑，得黃色油狀物，為化合物Ⅰ。使用HPLC法檢測并用峰面積歸一化法計算，其質量分數大于98.00%。

2.4 三氯甲烷部位成分分離

取甲醇溶解三氯甲烷部位稠浸膏(46.2 g)，加入1.5倍量硅膠(80～100目)拌樣，研磨均勻，水浴揮至無醇味，上樣。依次用環己烷-乙酸乙酯(體積比100∶0～0∶100)進行梯度洗脫，每份收集約100 mL，共收集252份。經TLC檢視，相同流分合并。結果：第 47～77 流分合并，減壓濃縮，析出黃色針狀晶體，用無水乙醇洗滌后重結晶，得化合物Ⅱ；第119～165 流分合并，減壓濃縮，冷藏放置濃縮液，析出無色透明晶體，經環己烷-乙酸乙酯體系重結晶，得化合物Ⅲ；第178～212 流分合并，減壓濃縮，用少量乙酸乙酯溶解后加入環己烷至稍渾濁，放置析出米黃色粉末，得化合物Ⅳ。

2.5 乙酸乙酯部位成分分離

2.5.1 硅膠柱色譜初步分離 取甲醇溶解乙酸乙酯部位浸膏(47.8 g)，用1.5倍硅膠(80～100目)拌樣，研磨均勻，水浴鍋上揮至無醇味，上樣。用環己烷-乙酸乙酯(體積比100∶0～0∶100)進行梯度洗脫，每份收集約100 mL，共收集145份，經TLC檢視，相同流分合并。合并第 21～35流分，減壓回收溶劑，待用；合并第 64～144流分，減壓回收溶劑，待用。

2.5.2 C18反相硅膠柱色譜分離 用少許甲醇溶解收集到的21～35、64～144流分，加入1.5倍量C18反相硅膠拌樣，水浴揮至無醇味，上樣。依次用甲醇-水(體積比10∶90～100∶0)進行梯度洗脫，經TLC展開劑展開各流分，1%AlCl3顯色，在254、365 nm紫外光下檢視，相同組分合并，濃縮，放置析晶。結果：第21～35流分經C18柱后的第13～23流分進行合并，放置揮發溶劑，析出白色粉末，甲醇重結晶，得到化合物Ⅶ；第64～144 流分經C18反相硅膠柱后的第12～22流分進行合并，放置24 h，析出棕色沉淀，三氯甲烷-甲醇(1∶1)重結晶后得到化合物Ⅴ；第64～144流分經C18反相硅膠柱后第26～34流分合并，放置24 h，析出淺棕色沉淀，用乙酸乙酯重結晶后得到淺棕色粉末狀化合物Ⅵ。

3 結構鑒定

化合物Ⅰ：棕黃色油狀物，易溶于石油醚、三氯甲烷；易被氧化，被氧化后顏色加深，宜避光密封保存；最大吸收波長為293.2 nm；經HPLC檢測并用峰面積歸一化法計算得其質量分數為98.00%；EI-MSm/z，分子離子峰293.3[M+Na]+；核磁數據歸屬：1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：6.61(1H，s，H-3)，6.95(1H，s，H-6)，5.28(1H，br.d，J=6.6 Hz，H-7)，6.43(1H，ddd，J=17.1，10.2，6.6 Hz，H-8)，5.09(1H，dt，J=17.1，1.6 Hz，H-9a)，5.34(1H，dt，J=10.2，1.6 Hz，H-9b)，7.35-7.41(4H，m，H-2′，H-3′，H-5′，H-6′)，7.29(1H，br.t，J=6.7 Hz，H-4′)，3.80(3H，s，2-OCH3)，3.87(3H，s，4-OCH3)，5.77(1H，br.s，OH)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ(124.1(C-1)，150.2(C-2)，97.2(C-3)，145.0(C-4)，139.1 (C-5)，115.2(C-6)，46.7(C-7)，140.3(C-8)，115.6 (C-9)，143.0(C-1′)，127.8(C-2′，C-6′)，128.3(C-3′，C-5′)，125.7(C-4′)，55.7(2-OCH3)，56.5(4-OCH3)。經與文獻[18]對照，化合物Ⅰ與dalbergiphenol的波譜數據一致，故鑒定為dalbergiphenol，化學名：2,4-二甲氧基-5-[(s)-1苯基-2-丙烯基]苯酚。

化合物Ⅱ：黃色針狀結晶，易溶于三氯甲烷、乙酸乙酯，微溶于甲醇；易被氧化，宜避光密封保存；最大吸收波長為262.3 nm；經HPLC檢測并用峰面積歸一化法計算得其質量分數大于96.00%；mp：115～117 ℃； TLC檢測中，顯色前在254、365 nm紫外光下檢視無熒光，經1% AlCl3溶液顯色后在365 nm紫外光下檢視顯黃色熒光，可見光下顯黃色；EI-MSm/z，分子離子峰255.1[M+H]+；核磁數據歸屬：1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：5.92(1H，s，H-3)，6.49(1H，d，J=1.2 Hz，H-6)，4.93(1H，br.d，J=6.7 Hz，H-7)，6.10(1H，ddd，J=17.2，10.3，6.7 Hz，H-8)，5.00(1H，dt，J=17.2，1.3 Hz，H-9a)，5.28(1H，dt，J=10.3，1.3 Hz，H-9b)，7.19(2H，br.d，J=7.4 Hz，H-2′，H-6′)，7.32(2H，br.t，J=7.4 Hz，H-3′，H-5′)，7.24(1H，br.t，J=7.4Hz，H-4′)，3.81(3H，s，4-OCH3)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ：151.0(C-1)，186.3(C-2)，107.9(C-3)158.4(C-4)，182.4(C-5)，131.6(C-6)，47.0(C-7)，137.2(C-8)，118.2(C-9)，139.3(C-1′)，128.5(C-2′，C-6′)，128.7(C-3′，C-5′)，127.2(C-4′)，56.3(4-OCH3)。經對比，波譜數據與參考文獻[19]中化合物5的波譜數據一致，故判定化合物Ⅱ為4-甲氧基黃檀醌(4-methoxydalbergione)。

化合物Ⅲ：無色透明針狀結晶，易溶于乙酸乙酯、甲醇等有機溶劑；最大吸收波長為236.3、350.5 nm； TLC檢測中，用1% AlCl3乙醇溶液顯色后在365 nm紫外光下為天藍色熒光，提示該化合物為黃酮類化合物。EI-MSm/z，分子離子峰587.1[2M+Na]+；核磁數據歸屬：1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：6.24 (1H，s，H-3)，6.91(1H，s，H-5)，6.86(1H，s，H-8)，7.43-7.56(5H，m，H-2′，H-3′，H-4′，H-5′，H-6′)，3.75(3H，s，6-OCH3)，3.96(3H，s，7-OCH3)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ：161.4(C-2)，112.3(C-3)，155.6(C-4)，111.3(C-4a)，107.3 (C-5)，146.0(C-6)，152.8(C-7)，100.2(C-8)，150.1(C-8a)，135.7(C-1′)，128.2(C-2′，C-6′)，128.9(C-3′，C-5′)，129.6(C-4′)，56.3(6-OCH3)，56.4(7-OCH3)。化合物Ⅲ的波譜數據與參考文獻[20]中化合物O-methyldalbergin的數據一致，故鑒定為黃檀素甲醚(O-methyldalbergin)。

化合物Ⅳ：米黃色顆粒狀結晶，易溶于乙酸乙酯、甲醇等有機溶劑；最大吸收波長為260.0、354.1 nm；mp：210～212 ℃； TLC檢測中，用1% AlCl3乙醇溶液顯色后在365 nm紫外光檢視下為藍綠色熒光，提示該化合物為黃酮類化合物。EI-MSm/z，分子離子峰559.3[2M+Na]+；核磁數據歸屬：1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：6.25(1H，s，H-3)，6.99(1H，s，H-5)，6.90(1H，s，H-8)，7.40-7.52(5H，m，H-2′，H-3′，H-4′，H-5′，H-6′)，3.99(3H，s，7-OCH3)，5.61(1H，s，6-OH)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ：161.5(C-2)，112.5(C-3)，155.7(C-4)，112.3(C-4a)，110.5(C-5)，142.4(C-6)，150.0(C-7)，99.6(C-8)，149.3(C-8a)，135.6(C-1′)，128.3(C-2′，C-6′)，128.8(C-3′，C-5′)，129.5(C-4′)，56.4(7-OCH3)。經與文獻[20]核對，鑒定化合物Ⅳ為黃檀素(dalbergin)。

化合物Ⅴ：棕色結晶，易溶于甲醇；最大吸收波長為237.5、277.8、344.5 nm。EI-MSm/z，分子離子峰323.3[M+Na]+；核磁數據歸屬：1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ：5.29(1H，dd，J=13.3，2.9 Hz，H-2)，2.99(1H，dd，J= 17.0，13.3 Hz，H-3ax)，2.66 (1H，dd，J=17.0，2.9 Hz，H-3)，7.18(1H，s，H-5)，6.57(1H，s，H-8)，6.93(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.78(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，6.80(1H，dd，J=8.1，1.8 Hz，H-6′)，3.89(3H，s，7-OCH3)。13C NMR(CD3OD,125 MHz)δ：81.3(C-2)，45.0(C-3)，193.8(C-4)，111.1(C-5)，142.8(C-6)，157.2(C-7)，101.2(C-8)，159.2(C-9)，114.6(C-10)，132.2(C-1′)，114.7(C-2′)，146.7(C-3′)，146.4(C-4′)，116.2(C-5′)，119.2(C-6′)，56.7(7-OCH3)。經與文獻[21-22]對照，化合物Ⅴ與3,4,6-trihydroxy-7-methoxyflavanone的波譜數據一致，故鑒定為3,4,6-三羥基-7-甲氧基環烷酮(3,4,6-trihydroxy-7-methoxyflavanone)。

化合物Ⅵ：棕黃色顆粒狀結晶；紫外最大吸收波長為238.7、280.1、345.7 nm。mp 212～215 ℃，易溶于乙醇，甲醇；EI-MSm/z，分子離子峰310.3[M+Na]+；核磁數據歸屬：1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ：5.23(1H，dd，J=13.3，2.9 Hz，H-2)，2.95(1H，dd，J=17.0，13.3 Hz，H-3ax)，2.63(1H，dd，J=17.0，2.9 Hz，H-3eq)，7.17(1H，s，H-5)，6.38(1H，s，H-8)，6.91(1H，br.S，H-2′)，6.76(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，6.78(1H，br.D，J= 8.1 Hz，H-6′)。13C NMR(CD3OD,125 MHz)δ：81.1(C-2)，45.0(C-3)，193.8(C-4)，111.4(C-5)，142.1(C-6)，156.0(C-7)，104.2(C-8)，159.3(C-9)，114.0(C-10)，132.2(C-1′)，114.6(C-2′)，146.7(C-3′)，146.4(C-4′)，116.2(C-5′)，119.2(C-6′)。經與文獻[21]對照，化合物Ⅵ與plathymenin的波譜數據一致，故鑒定為黃蘇木素(plathymenin)。

化合物Ⅶ：黃白色粉末，易溶于三氯甲烷；經HPLC檢測并用峰面積歸一化法計算得其質量分數大于98.00%；mp：216～218 ℃； TLC檢測中，用1% AlCl3乙醇溶液顯色后在254、365 nm紫外光下檢視，均顯亮黃色熒光。EI-MSm/z，分子離子峰284[M+H]+；核磁數據歸屬：1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ12.92(1H，s，5-OH)，10.87(1H，s，7-OH)，8.35(1H，s，2-H)；δ7.5(2H，dd，J=2.75，8.93 Hz，H-2′，6′)，7.0(2H，dd，J=2.99，8.96 Hz，H-3′，5)；δ6.39(1H，d，J=2.14 Hz，H-8)，6.23(1H，d，J=2.14 Hz，H-6)；δ3.79(3H，s，4′-OCH3)。13C NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ180.5(C-4)，164.28(C-7)，161.95(C-5)，159.12(C-4′)，157.55(C-9)，154.18(C-2)，130.10(C-2′)，130.10(C-6′)，122.89(C-3)，121.92(C-1′)，113.66(C-3′)，113，66(C-5′)，104.43(C-10)，98.98(C-6)，93.66(C-8)，55.12(4′-OCH3)。經鑒定，該物質為鷹嘴豆芽素A(biochanin A)。

以上化合物的分子結構式見表1，混合對照品、醇提物溶液的HPLC色譜圖見圖2。

表2 印度黃檀的化學成分Table 2 Chemical constituents of Dalbergia sissoo Roxb.

表2 (續)

0.800.600.400.200.000.150.100.050.00AUAU10152025303540455005t/minBA7654321123456

1. 2,4二甲氧基-5-[(s)-1苯基-2-丙烯基]苯酚； 2 .4-甲氧基黃檀醌； 3.黃檀素甲醚； 4.黃檀素； 5. 3,4,6-三羥基-7-甲氧基環烷酮； 6.黃蘇木素； 7.鷹嘴豆芽素A。

圖2印度黃檀主要化學成分混合對照品溶液(A)、印度黃檀醇提液(B)的HPLC色譜圖

Figure2HPLC chromatograms of monomers mixed solution (A) and alcohol extract ofDalbergiasissooRoxb.(B)

4 結論

通過硅膠柱、C18反相硅膠柱2種柱色譜方法，結合萃取法、溶劑法、重結晶法等對印度黃檀醇提物石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取部位進行分離提純。運用質譜、核磁等波譜數據，并參考文獻資料，對化合物的結構進行鑒定。從石油醚部位分離得到化合物Ⅰ，鑒定為2,4-二甲氧基-5-[(s)-1-苯基-2-丙烯基]苯酚(dalbergiphenol)。三氯甲烷部位分離得到化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，分別鑒定為4-甲氧基黃檀醌(4-methoxydalbergione)、黃檀素甲醚(O-methyldalbergin)和黃檀素(dalbergin)，并使用HPLC峰面積歸一法測定質量分數[23]。乙酸乙酯部位分離純化得到化合物Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ，分別鑒定為3,4,6-三羥基-7-甲氧基環烷酮(3,4,6-trihydroxy-7-methoxyflavanone)、黃蘇木素(plathymenin)和鷹嘴豆芽素A (biochanin A)。通過HPLC峰面積歸一化法計算，2,4-二甲氧基-5-[(s)-1-苯基-2-丙烯基]苯酚、4-甲氧基黃檀醌、黃檀素甲醚、黃檀素、黃蘇木素等5種成分的質量分數占總成分的90%以上，為印度黃檀乙醇提取物中的主要成分。經分析發現7種化合物均為黃酮類化合物，其中有2種為新黃酮結構，2種具有查爾酮結構，2種有二氫黃酮類母體結構，1種有異黃酮類結構。黃酮類化合物具有多種生物活性，后期研究將對提取分離的單體化合物進行生物活性研究，為印度黃檀的資源開發利用提供更充分、科學、可靠的研究基礎和依據。