響應面法優化蘆柑皮中檸檬苦素類化合物的提取工藝

湯海霞，董雅嫻，賁永光

(廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006)

蘆柑又名真柑、乳柑、柑果，是柑橘中最常見的品種之一，在我國南方廣泛種植，其味道芳香甘美，風味獨特，具有生津止渴、和胃利尿等功效，在國內外農產品貿易中占有非常重要的地位[1]。隨著蘆柑產量的逐年增加，蘆柑果皮的綜合利用就越發顯得重要。但是，國內大部分蘆柑皮渣未得到充分利用，傳統做法是加工成動物飼料、肥料或廢棄物處理，經濟效益低，且易污染環境[2-4]。目前，國內對于資源節約和環境保護的重視，使得皮渣的綜合利用日益被關注。

蘆柑果皮中含有香精油、果膠、桔皮色素、柑橘纖維、黃酮類化合物和類檸檬苦素等功能性成分，這些成分在食品、醫藥等方面具有廣泛的用途。檸檬苦素類化合物也是蘆柑果皮中一種主要生理活性成分，是一類高度氧化的含呋喃環三萜類化合物，具有諸多生物學功能，如抗氧化性、抑菌性和抗腫瘤性等[5-7]。檸檬苦素類化合物在加工處理過程中容易發生結構的變化，甚至會使其失去活性。因此，在提取、分離、純化檸檬苦素類化合物的過程中必須嚴格控制溫度、pH值等因素[8]。

目前，檸檬苦素類化合物的主要提取方法有有機溶劑法、系統溶劑提取法、超聲波提取法、超臨界萃取法等[9-11]。相比傳統的提取方法，超聲提取具有提取時間短、節約溶劑、提取率高、應用廣泛等優勢和特點[12]。本文旨在探討超聲輔助提取蘆柑皮中檸檬苦素類化合物的工藝，并采用響應面法優化工藝條件，以期為柑橘果皮的綜合利用提供理論依據與工藝參考。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器)；KQ-400DB型臺式數控超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設備有限公司)；752N紫外/可見分光光度儀(上海儀電分析儀器設備有限公司)。

1.2 原料與試劑

蘆柑(產地：福建漳州)，經廣東藥科大學中藥學院滕希峰講師鑒定為蕓香科柑橘屬(Citrus reticulata Blanco)蘆柑品種；檸檬苦素對照品(質量分數≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；石油醚、無水乙醇(分析純，天津致遠化學試劑有限公司)；對二甲氨基苯甲醛、三氯化鐵、二氯甲烷(分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；H2SO4(分析純，廣州化學試劑廠)。

2 方法與結果

2.1 樣品前處理

取蘆柑手工去皮，將果皮用自來水清洗干凈后，再用去離子水沖洗干凈，置于烘箱內(40～50 ℃，48 h)烘至水分的質量分數為5%左右，經粉碎機粉碎后，過40目篩。稱量過篩后的蘆柑皮粉末的重量，放入錐形瓶中并加入石油醚(1 g蘆柑皮粉末加入100 mL石油醚)，密封，放置恒溫箱中，37 ℃浸泡脫脂10 h，抽濾除去石油醚后，放置烘箱中60 ℃干燥，干燥后放于密封袋中，備用。

2.2 檸檬苦素類化合物的測定方法

2.2.1 顯色劑的配置 顯色劑A液：將125 mg對二甲氨基苯甲醛溶于100 mL的H2SO4和乙醇混合液中(H2SO465 mL，無水乙醇35 mL)，放冷備用。顯色劑B液：稱取FeCl39.0 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL；使用時，現配現用，將B溶液0.5 mL加入到A溶液，搖勻即可[1]。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取檸檬苦素對照品15.0 mg，溶于無水乙醇中后轉移至50 mL容量瓶，定容，得300 μg/mL的對照品溶液，待用。取1 mL，加入無水乙醇2 mL，再加5 mL顯色液，搖勻，靜置30 min后進行光譜掃描，于500 nm波長下檢測吸光度。

精密移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL對照品溶液于7個試管中，并以無水乙醇稀釋至3 mL，再分別加入5 mL顯色液，以檸檬苦素空白液為參比，顯色30 min后在500 nm處測定其吸光度。得到標準曲線方程：y=0.002 5x+0.002 5，R=0.999 1。

2.2.3 樣品的處理與測定 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉于試管中，按一定料液比，加入一定濃度的提取溶劑，在一定超聲功率下超聲一定時間后，抽濾得到提取液，提取液經減壓濃縮，濃縮液溶于二氯甲烷并過濾，濾液經減壓濃縮后用無水乙醇復溶，轉移至25 mL容量瓶，定容。精密吸取溶液3 mL，加入5 mL顯色劑，搖勻，靜置顯色30 min后于500 nm處測定吸光度。按下列公式計算檸檬苦素類化合物的提取率(Y)：

式中：C為標準曲線對應的檸檬苦素類化合物質量濃度，μg/mL；D為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；W為原料質量，g。

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取時間的選擇 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉5份于試管中，固定液料比為15∶1(mL∶g)，乙醇體積分數為70%，超聲功率為400 W，考察超聲時間分別為12、14、16、18、20 min對檸檬苦素類化合物提取率的影響，結果見圖1(A)。可見,提取時間為14 min時，檸檬苦素類化合物的提取率最佳。

2.3.2 液料比的選擇 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉5份于試管中，固定提取時間為14 min，乙醇體積分數為70%，超聲功率為400 W，考察液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1(mL∶g)對檸檬苦素類化合物提取率的影響，結果見圖1(B)。可見，當物料比為15∶1 mL/g時，檸檬苦素類化合物的提取率最佳。

2.3.3 超聲功率的選擇 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉5份于試管中，固定提取時間為14 min，液料比為15∶1，乙醇體積分數為70%，考察超聲功率為240、280、320、360、400 W對檸檬苦素類化合物提取率的影響，結果見圖1(C)。可見，當超聲功率為360 W時，檸檬苦素類化合物的提取率最佳。

2.3.4 提取溶劑體積分數的選擇 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉5份于試管中，固定提取時間為14 min，液料比為15∶1，超聲功率為360 W，考察乙醇體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%時對檸檬苦素類化合物提取率的影響，結果見圖1(D)。可見，當乙醇體積分數為80%左右時，檸檬苦素類化合物的提取率最佳。

提取率//(mg?g-1)765432107654321076543210876543210101214161820222002402803203604004401015202530055060708090提取時間/min液料比/(mL∶g-1)超聲功率/W乙醇體積分數/%ABCD

圖1提取時間(A)、料液比(B)、超聲功率(C)和乙醇體積分數(D)對檸檬苦素類化合物提取率的影響

Figure1Effect of time (A),solid-to-solvent ratio (B),ultrasonic power (C),ethanol concentration (D) on the extraction yield of limonoids

2.4 響應面法優化檸檬苦素類化合物的提取工藝

2.4.1 因素與水平的選取 根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用4因素3水平響應面分析方法，在單因素試驗的基礎上，以1、0、-1分別代表自變量的高中低水平，試驗因素與水平見表1。

表1 因素與水平設計表Table 1 The factors and levels for RSA

注：X1=(X1-80)/10；X2=(X2-360)/40；X3=(X3-15)/5；X4=(X4-14)/2。

2.4.2 回歸方程的建立 在4因子Box-Benhnken試驗設計中試驗號1-24是析因試驗點，試驗號25-29是零點試驗，其中析因點為自變量X1、X2、X3、X4所構成的三維頂點；零點區域為中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。以X1、X2、X3、X4為自變量，以原料中檸檬苦素類化合物提取率為響應值(Y)，試驗設計和結果見表2。將結果利用軟件DesignExpert8.0分析處理，得到以檸檬苦素提取率(Y)為響應值的二次回歸方程：

Y=8.11-0.042X1+0.064X2-0.017X3+0.032X4-0.024X1X2-6.711-3X1X3-0.023X1X4-0.097X2X3-0.056X2X4+0.11X3X4-1.03X12-0.22X22-0.36X32-0.20X42。

2.4.3 回歸模型分析 用軟件DesignExpert8.0對回歸模型進行方差分析，以檸檬苦素類化合物提取率為響應值的回歸模型方差分析見表3。

由表3可知，失擬項F值=3.05，檢驗不顯著，說明失擬平方和較小，基本是由試驗誤差等偶然因素引起的，擬合良好。回歸項F值=16.24，檢驗極顯著(P<0.01)，且回歸方程決定系數R2為0.942 0，修正決定系數AdjR2為0.884 0，說明該模型與實際擬合良好，可用于蘆柑果皮中提取檸檬苦素類化合物的分析和預測。

2.4.4 各因素交互作用分析 為進一步直觀說明乙醇體積分數(X4)、提取時間(X1)、超聲功率(X3)和液料比(X2)之間的相互作用對檸檬苦素類化合物提取率的影響，根據試驗結果做出相應的響應面3D圖和等高圖，見圖2。可見，各因素之間兩兩交互作用對檸檬苦素類化合物提取率的影響均均無統計學意義。

2.4.5 最佳工藝與驗證試驗 由軟件DesignExpert8.0預測出檸檬苦素類化合物提取條件優化結果為：提取時間14.29min，液料比15.25∶1 (mL∶g)，超聲功率358.61W，乙醇體積分數80%，檸檬苦素類化合物提取率預測可達8.12mg/g。為實際操作方便，將上述最優提取條件簡化為：提取時間14min，液料比15∶1 (mL/g)，超聲功率360W，乙醇體積分數80%。進行3次重復試驗，結果測得提取率分別為8.07、8.10、8.03mg/g，平均提取率為8.07mg/g，RSD=0.01%，與理論預測值相差很小，且RSD值較小，精密度較好，說明采用響應面優化得到的提取條件可靠。

表2 Box-Benhnken響應面試驗設計和結果Table 2 Design and experimental results of Box-Benhnken response surface method

表3 方差分析結果Table 3 The analysis of variance

注：*P<0.05為差異有統計學意義；R2=0.942 0，AdjR2=0.884 0。

X2:液料比/(mL∶g)X4:乙醇體積分數/%X1:提取時間/minX3:超聲功率/WX4:乙醇體積分數/%X4:乙醇體積分數/%X3:超聲功率/WX1:提取時間/minX1:提取時間/minX3:超聲功率/WX2:液料比/(mL∶g)X2:液料比/(mL∶g)BACDEF

圖2各因素交互作用的響應面圖

Figure2ResponsiveSurfaceandcontoursoftheinteractionofeachfactors

3 討論

本文對蘆柑皮中檸檬苦素類化合物的超聲提取工藝進行了研究，考察了超聲功率、提取時間、液料比、提取溶劑濃度等因素對檸檬苦素類化合物提取率的影響，采用響應面分析法優選最佳提取工藝條件，在此最優工藝條件下，蘆柑皮中檸檬苦素類化合物的提取率為8.07 mg/g，與文獻報道的用酸堿水提取蘆柑皮中檸檬苦素的結果(0.133 mg/g和0.117 mg/g)[14-15]比較，本文的提取率明顯提高，且減少了酸堿和有機溶劑等的使用，污染環境可能性小，體現了超聲技術操作簡單、高效和節能等優點。