正交試驗法優化鐵皮石斛多糖的高效高壓差低溫連續式提取工藝

宋力飛，劉常青，馬志鵬，王旭龍，羅俊，容永賜，李偉杰

(廣州澤力醫藥科技有限公司，廣東廣州 510663)

鐵皮石斛是一種具有藥食同源屬性的名貴中藥材，又名鐵皮蘭、黑節草，為蘭科石斛屬植物，主要分布于我國安徽、浙江、福建等地，具有增強體質、滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳的功效，素有九大仙草之首的美名[1-2]。

鐵皮石斛中含有多種化學成分，包括多糖、生物堿、氨基酸、礦物質等，其中多糖是含量較高的有效成分[3-4]。目前，植物多糖的提取技術主要是水提醇沉法、微波法、超聲波輔助水提法、超臨界流體萃取法等[5]，提取效率較低。本研究首次運用高效高壓差低溫連續式提取分離濃縮技術及成套裝備對鐵皮石斛多糖進行提取，并以多糖提取率為指標，采用正交試驗法優化工藝參數，為規模化提取鐵皮石斛多糖提供一定的技術支持與理論指導。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛：產地福建，經宋力飛高級工程師鑒定為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的莖；D-無水葡萄糖標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201506，質量分數99.9%)；苯酚、硫酸、無水乙醇(天津市凱通化學試劑有限公司，分析純)。

1.2 儀器與設備

高效高壓差低溫連續式提取分離濃縮技術及成套裝備(HHLSE，廣州澤力醫藥科技有限公司)；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；20B萬能粉碎機(江蘇省江陰市瑞通機械設備有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 工藝流程

本研究是在小試(每次試驗量約為3 kg鐵皮石斛粉)基礎上完成的，中試為30 kg。鐵皮石斛多糖提取采用水提方式(冷凍水循環，保持溫度<25 ℃)，工藝流程：鐵皮石斛→預處理→粉碎→高效高壓差低溫連續式提取→離心(渣液分離)→微濾(取清液)→反滲透(取濃液)→真空濃縮→粗多糖。

2.2 鐵皮石斛多糖提取率的測定

2.2.1 標準曲線的繪制 準確稱取0.100 g干燥至恒定質量的葡萄糖對照品，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液，分別精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL對照品溶液，加水至總體積為2 mL，加入質量分數5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，再加濃硫酸5.0 mL，搖勻，沸水浴煮沸15 min。冰浴冷卻后在490 nm處測量吸光度，以質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線[6-7]，得回歸方程y=14.859x-0.001 3，r=0.999 2，線性范圍為0～0.6 mg/mL。

2.2.2 鐵皮石斛多糖提取率的測定 采用苯酚-硫酸法[6]進行測定：取真空濃縮到一定倍數的提取液1.0 mL，加水至總體積為2 mL，其余步驟“2.2.1”項下操作，得到提取液鐵皮石斛多糖濃度，進而得粗多糖質量，再根據公式“多糖提取率=粗多糖質量÷鐵皮石斛粉質量×100%”計算多糖提取率。

2.3 單因素試驗

通過高效高壓差低溫連續式提取分離濃縮技術及成套裝備對鐵皮石斛多糖的提取，以多糖提取率為評價指標，在預試驗的基礎上，選擇粉碎度、料液比、提取壓力為主要影響因素進行單因素試驗，考察各因素對鐵皮石斛多糖提取率的影響。

2.3.1 粉碎度對多糖提取率的影響 固定料液比為1∶20，提取壓力為30 MPa，確定粉碎度在網篩口徑為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mm條件下對多糖提取率的影響，結果見圖1。

多糖提取率/%4035302520151050網篩口徑/mm0.40.81.21.62.0

圖1粉碎度對多糖提取率的影響

Figure1Effect of grinding degree on extraction rate of polysaccharides

可見，粉碎度在0.8～1.0 mm范圍內，隨著網篩口徑的提高，對鐵皮石斛的多糖提取率不斷提高，粉碎度達到1.0 mm時，達到最大的多糖提取率32.9%；粉碎度大于1.0 mm時，多糖提取率的提升變化并不明顯。為節約資源，將鐵皮石斛的粉碎度確定為1.0 mm。

2.3.2 料液比對多糖提取率的影響 固定粉碎度為1.0 mm、提取壓力為30 MPa，考察料液比在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30條件下對多糖提取率的影響，結果見圖2。

4035302520151050料液比/(g∶mL)多糖提取率/%1∶101∶151∶201∶251∶30

圖2料液比對多糖提取率的影響

Figure2Effect of ratio of dried powder ofDendrobiumcandidumto water on extraction rate of polysaccharides

可見，隨著料液比的增大，多糖提取率呈不斷增大趨勢，當料液比為1∶25時，多糖提取率最高，達到35.4%；當料液比進一步增大時，鐵皮石斛的多糖提取率變得平緩且有下降的趨勢。所以，確定料液比為1∶25。

2.3.3 提取壓力對多糖提取率的影響 固定粉碎度為1.0 mm、料液比為1∶25，考察提取壓力在25、30、35、40、45 MPa條件下對多糖提取率的影響，結果見圖3。

504540353025201510502530354045提取壓力/MPa多糖提取率/%

圖3提取壓力對多糖提取率的影響

Figure3Effect of extraction pressure on extraction rate of polysaccharides

可見，提取壓力在25～40 MPa范圍內，鐵皮石斛多糖提取率隨著提取壓力的不斷增大而增大，當提取壓力為40 MPa時，多糖提取率達到最大值的44.8%。在此之后，隨著提取壓力的增大，多糖提取率的變化趨于平緩。為保護設備、節約資源，將鐵皮石斛多糖提取工藝的提取壓力確定為40 MPa。

2.4 正交試驗設計優化鐵皮石斛多糖提取工藝

2.4.1 正交試驗設計 在單因素試驗的結果基礎上，選擇對鐵皮石斛多糖提取影響較大的粉碎度、料液比、提取壓力等因素，以鐵皮石斛多糖提取率為評價指標，運用正交試驗對提取工藝條件進行優化,采用 L9(34)正交表進行試驗，因素與水平見表1，使用SPSS 19.0統計軟件對結果進行分析。

表1 正交試驗因素與水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

2.4.2 直觀分析法 鐵皮石斛多糖提取工藝優化的正交試驗結果見表2。可見，影響鐵皮石斛多糖提取率的因素主次順序為C(提取壓力)>B(料液比)>A(粉碎度)，最佳工藝條件為A3B2C2，即：粉碎度1.2 mm，料液比1∶25，提取壓力40 MPa。按此條件的試驗在正交表中并沒有出現，通過做補充試驗，得到的多糖提取率為48.5%，大于正交試驗結果中的最高值，說明利用正交試驗優化鐵皮石斛的多糖提取工藝是有效的。

表2 正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal test design and results

2.4.3 方差分析 采用SPSS 19.0統計軟件對正交試驗的結果數據進行方差分析，結果見表3。可見，因素A、B、C的P值均<0.05，說明它們對多糖提取率的影響都具有統計學意義，其中因素C(提取壓力)的影響極顯著，順序為C>B>A，結論與直觀分析法的一致。

表3 方差分析結果表Table 3 Variance analysis

注：R2=0.998(調整R2=0.992)。

2.5 中試放大試驗

本研究進行了3次中試(32.5 kg)放大試驗，結果見表4。可見，中試結果鐵皮石斛多糖提取率的RSD值為0.89%，表明所用工藝合理可行，穩定可靠；中試試驗得到的平均多糖提取率為45.0%，與小試(3 kg)得到的結果有一定的差別。

表4 中試放大試驗結果Table 4 The medium test results

3 討論

目前，關于鐵皮石斛多糖提取工藝的研究較多，基本上集中在實驗室階段，且研究的量很小(<10 g)，普遍采用熱水浸提，得到的多糖提取率都比較低，大多在30%左右[8-9]，其中單冰冰等[10]采用均勻設計法優化熱提取工藝能得到相對較高的提取率(41.3%)，但也明顯小于本研究得到的結果。

本研究首次采用高效高壓差低溫連續式提取分離濃縮技術及成套裝備在低溫條件下對鐵皮石斛多糖進行提取，并結合正交試驗法優化其提取工藝，最佳提取工藝參數為：粉碎度1.2 mm，料液比1∶25，提取壓力40 MPa。中試試驗時，除了粉碎度和料液比保持一致，提取壓力調整為一定的范圍，原因是提取器的工作原理是電機帶動柱塞往復運動，使料液加壓通過突然變窄的出口，進而達到高壓破壁的提取效果；但由于出口很窄，很容易造成物料粉末堆積，使突然壓力升高，當壓力升高至一定值時，堆積在出口的物料粉末由于壓力的作用沖出出口，使積蓄的壓力得到釋放，所以，提取壓力調整為波動的范圍。在優化的最佳條件下鐵皮石斛多糖提取率為48.5%，而中試(32.5 kg)的結果為45.0%，小試與中試在提取率上有一些差異是因為中試的設備更大，管路更長，設備、管路中的殘留損失也越多，需要在實際生產中摸索更加適宜的最佳工藝條件。

本研究以高效高壓差低溫連續式提取分離濃縮技術(HHLSE)及成套裝備為核心，通過提取設備形成的高壓差對鐵皮石斛細胞進行破碎，提高了提取率，并結合膜分離、濃縮等設備達到分離濃縮，此方法的優勢在于提取過程在常溫甚至在20 ℃以下的條件下即可實現成分的高效提取濃縮，具有提取效率高、時間短、節能的優點，可為鐵皮石斛多糖的規模化生產提供一定的理論指導。