一測多評法測定肉蓯蓉枳殼顆粒中7種成分的含量

黃乾峰，李浩賢，林華慶，余楚欽

(廣東藥科大學/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006)

肉蓯蓉枳殼顆粒處方由肉蓯蓉、枳殼、白術組成。處方中肉蓯蓉養血潤腸，枳殼調暢氣機，以助大腸推動之力，故可用于各種虛秘，尤其適用于老年性便秘[1]。松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷等苯乙醇苷類成分為肉蓯蓉提取物中的主要活性成分[2]，枳殼提取物的主要活性成分為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷[3]。現行《中國藥典》對枳殼項目下柚皮苷和新橙皮苷有定量要求[4]246，便通膠囊項下肉蓯蓉也有定量要求，要求測定肉蓯蓉中的松果菊苷[4]1253；其他活性成分研究文獻也有相關的報道[5]。《中國藥典》中主要以單一成分為指標的質量控制，無法完全反映中藥“整體”的理念，而測定多指標的質量控制方法則需要對照品的種類和數量均比較大，且部分對照品價格昂貴(毛蕊花糖苷、松果菊苷等)。

一測多評法(QAMS)是在多指標質量控制時，以樣品中對照品廉價易得的典型成分為內標，建立該成分與其他成分間的相對校正因子(RCF),再通過RCF計算出其他成分的量的方法，可實現使用少量對照品對多種成分的同步定量測定[6]。本研究采用QAMS法對肉蓯蓉枳殼顆粒的7種有效成分進行同時測定，以成本低廉的柚皮苷為內參物，分別建立與松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷、橙皮苷、新橙皮苷的RCF，用外標法(ESM)測定柚皮苷的質量分數，根據RCF,計算其他成分的質量分數，并將QAMS的結果與外標法的結果進行比較，驗證QAMS法結果的準確性和可靠性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(美國Dionex公司)；色譜柱為Jade-pak ODS-AQ(5 μm，250 mm×4.6 mm)、YMC-Pack Pro C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)、Diamonsil C18(2)(5 μm，250 mm×4.6 mm)；AJ0-4287 Security GuardTMCartridges C18保護柱;CP225D型電子分析天平(德國Sartorius公司);BS224S型電子分析天平(德國Sartorius公司)；KH-400KDB型高功率數控超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

肉蓯蓉枳殼顆粒(自制產品，批號20180908,20180913,20180917)；松果菊苷(批號111670-200502、111670-201706,質量分數89.7%)、毛蕊花糖苷(批號111530-201713，質量分數92.5%)、柚皮苷(批號110722-201714，質量分數93.4%)；橙皮苷(批號110721-201617，質量分數96.1%)；新橙皮苷(批號111857-201703，質量分數99.2%)均由中國食品藥品檢定研究院提供；管花苷A(批號M0906AS，質量分數98%)、異毛蕊花糖苷(異類葉升麻苷，批號 M0106AS，質量分數98%)由大連美侖生物技術有限公司提供；甲醇(色譜純)；水(屈臣氏蒸餾水)；甲酸(天津科密歐，批號 20180110，HPLC級)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Jade-pak ODS-AQ 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫(0～20 min,30%～36.6%甲醇；20～25 min，36.6%～33.4%甲醇；25～45 min，33.4%甲醇；45～55 min，30%甲醇)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：283 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷適量，以50%(體積分數，下同)甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為松果菊苷0.202 mg/mL、毛蕊花糖苷0.204 mg/mL、管花苷0.204 mg/mL、異毛蕊花糖苷0.200 mg/mL、柚皮苷0.210 mg/mL、新橙皮苷0.202 mg/mL、橙皮苷0.400 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品單一包裝量，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理40 min，取出放冷后，稱定質量，以50%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取處方比例及同樣制備工藝制得的不含肉蓯蓉、枳殼的陰性對照樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統適用性及專屬性試驗

分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL進樣，結果如圖1。可見，松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷與其鄰近的色譜法分離度皆大于1.5，拖尾因子在1.04～1.10之間，理論塔板數均在10 000以上，陰性對照在相應位置處未見色譜峰，方法專屬性良好。

010203045t/minABCD543211674765327654321

A.混合對照品； B.供試品； C.陰性樣品(缺肉蓯蓉)； D.陰性樣品(缺枳殼)； 1.松果菊苷； 2.管花苷A； 3.毛蕊花糖苷； 4.柚皮苷； 5.異毛蕊花糖苷； 6.橙皮苷； 7.新橙皮苷。

圖1高效液相色譜圖

Figure1HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液適量進行稀釋，得到系列混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣檢測，記錄色譜圖。以對照品質量濃度(x，μg/μL)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表1。

2.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12 h進樣10 μL測定，記錄各組分色譜峰峰面積，計算RSD值。結果松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的峰面積的RSD分別為0.75%、0.30%、0.34%、0.60%、0.84%、0.90%、0.43%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.6 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續重復進樣 6次，記錄各組分色譜峰峰面積，計算 RSD值。結果松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的峰面積的RSD分別為0.69%、1.69%、0.54%、1.34%、0.64%、1.80%、0.35%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一供試品，按“2.3”項下平行制備供試品溶液 6 份，分別進樣10 μL測定，記錄各組分色譜峰峰面積，計算RSD值。結果松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的平均含量(n=6)分別為4.312 1、5.312 1、0.891 2、0.468 9、0.461 2、1.085 6、2.300 2 μg/g，RSD分別為0.69%、1.79%、1.19%、1.43%、0.58%、1.70%、0.51%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知質量分數的肉蓯蓉枳殼顆粒，研細，取約1 g，精密稱定6份，按照“2.2.2”項下方法制備溶液。精確量取1 mL至2 mL容量瓶內，再精確加入1 mL的松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷混合對照品溶液，混勻。依次取10 μL濾液進樣測定。結果測得松果菊苷的平均回收率為100.8%(RSD=0.7%)、毛蕊花糖苷的平均回收率為99.50%(RSD=1.4%)、管花苷的平均回收率為101.1%(RSD=1.6%)、異毛蕊花糖苷的平均回收率為102.4%(RSD=0.60%)、柚皮苷的平均回收率為100.7%(RSD=1.2%)、新橙皮苷的平均回收率為101.4%(RSD=1.5%)、橙皮苷的平均回收率為 99.83%(RSD=1.1%)。

表1 7種成分的線性關系考察結果Table 1 Linear investigation result of 7 constituents

2.9 校正因子(fk/s)的計算

2.9.1 多點校正法 依照文獻[7]方法，取6個質量濃度的混合對照品溶液分別測定,計算各濃度點所得的fk/s，取平均值作為定量用fk/s，結果見表2。校正因子(fk/s)計算公式：fk/s=(Cs×Ak)/(Ck×As)；待測成分質量濃度計算公式：Ck′=(Cs×Ak′)/(fk/s×As)，式中：Cs為參照物質量濃度，As為參照物色譜峰峰面積，Ck為其他對照組分質量濃度，Ak為其他對照組分色譜峰峰面積，Ck′為待測組分質量濃度，Ak′為待測組分色譜峰峰面積。

2.9.2 斜率校正法 在標準曲線Y=aX+b中，X=(Y-b)/a=Y/a-b/a，由于b值通常為誤差引起，在a/b值大于100時，b/a值可以忽略不計，此時可以X=Y/a直接計算。故fk/s可以二者的斜率a之比直接計算，即fk/s=ak/as，即可以參照物快速推算其余待測成分的量Ck′[Ck′=Ak′/(as×fk/s)]，式中：as為參照物斜率，ak為其他對照組分斜率。應用此法需先建立參照物的標準曲線獲得其as。本文以斜率校正法測得松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、橙皮苷、新橙皮苷相對于柚皮苷的fk/s分別為0.379、0.422、0.563、0.600、0.453、1.14。

2.9.3fk/s的耐用性考察 考察了不同色譜柱、不同流速、不同柱溫的重現性，考察其耐用性，結果見表3。結果顯示，校正因子的耐用性良好。

2.9.4 待測組分色譜峰的定位 柚皮苷通過對照品定位，其他待測組分采用相對柚皮苷保留時間(relative retention time;RRT值)進行定位。采用一測多評法進行測定時，通過柚皮苷的保留時間計算其他待測組分峰的RRT數值，根據RRT值及光譜吸收可對其他6個組分進行準確定位。本實驗測定了相對保留值在不同儀器、不同色譜柱、不同流速、不同柱溫的重現性，結果見表4。可見，各待測組分與柚皮苷的相對保留時間RSD均<5%。

2.10 QAMS法與外標法測定結果的比較

取3個不同批次的樣品分別進樣，先用外標法對肉蓯蓉枳殼顆粒中7種不同成分進行測定，再用QAMS法建立待測成分間的RCF對其他成分的質量分數進行計算，比較2種方法的計算結果，結果見表5。可見，2種方法所測得結果差異無統計學意義(相對誤差均<5%)，表明建立的QAMS法可用于肉蓯蓉枳殼顆粒的多成分質量評價研究。

表2 以柚皮苷為參照的fk/s(多點校正法)Table 2 fk/s with naringin as reference (multi-point correction method)

表3 校正因子(fk/s)的耐用性試驗結果Table 3 Robustness test of correction factors

注：3根色譜柱在檢測時帶AJ0-4287 SecurityGuardTMCartridges C18保護柱。

表4 不同條件下柚皮苷與其他組分的相對保留時間Table 4 Relative retention time between naringin and other components under different conditions

表5 QAMS法與外標法測定肉蓯蓉枳殼顆粒中7種成分的質量分數的結果比較

Table5Determination of seven components in Cistanche- Fructus aurantii granules by QAMS and external standard method(n=6)w/(μg·g-1)

3 討論

參考《中國藥典》中“肉蓯蓉”項下的前處理方法[4] 135-136，提取溶劑考察了體積分數分別為40%、50%、60%、70%的甲醇溶液，結果顯示50%甲醇提取時能將各組分提取完全；同時，考察了提取溶劑用量以及超聲時間的影響，結果表明加入液料比1∶20(g∶mL)的50%甲醇超聲處理40 min即可提取完全。

參考《中國藥典》中“便通膠囊”項下色譜條件[4]1253，考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.5%甲酸水溶液系統，結果顯示以甲醇-0.1%甲酸水系統的峰型更好、分離效果良好，本文選用甲醇-0.1%甲酸水系統作為流動相。

在待測的7個成分中，以柚皮苷的質量分數較高、且相對獨立，對照品價格便宜以及化學性質穩定，所以選用柚皮苷作為內參物。

本研究初步建立了一測多評法用于本研究所開發的肉蓯蓉枳殼顆粒中的7種成分的同步測定，與外標法實測值沒有顯著差異(相對偏差<5%)，表明建立的方法具有較好的可信度。本法與外標法相比，能極大地節約多成分質量分數測定的檢測成本，并為肉蓯蓉枳殼顆粒藥材、提取物、制劑的多指標質量控制模式提供新方法，為質量標準完善和質量評價提供參考依據。