丹參提取物及丹酚酸B對慶大霉素耳毒性保護作用的體內外研究

吳艾欣，李娟，陳鋼，溫露

(1.廣東藥科大學藥學院; 2.廣東省藥物新劑型重點實驗室; 3.廣東省局部精準遞藥制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510006)

耳聾是一種全球性常見疾病，發病率高。據世界衛生組織最新報道，全球大約有4.66億人患有聽力損失，超過全世界人口的5%，其中3 400萬是兒童[1]。藥源性耳聾是指由藥物耳毒性引起耳蝸尤其是毛細胞功能障礙而導致的聽力損失，嚴重危害患者的身心健康。具有耳毒性副作用的氨基糖苷類藥物慶大霉素是導致我國藥源性耳聾的主要藥物之一。現階段FDA尚未批準一個治療耳聾的藥物，因此亟需尋找有效的防治藥物。

中藥是中華民族的寶貴財富，對世界醫學的發展和我國民族的繁衍昌盛都有巨大的貢獻。丹參是傳統的活血化瘀中藥，主要含有脂溶性的醌類化合物如丹參酮ⅡA、隱丹參酮等；水溶性的酚酸類化合物如丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛等。研究發現，丹參及其制劑能預防藥物引起的耳毒性[2-5]和噪音引起的聽力損失[6]，丹參酮對突發性耳聾[7]和藥物誘導的耳毒性[8]有一定保護作用。本研究應用HEI-OC1細胞和斑馬魚模型進行體內外實驗，考察丹參提取物對慶大霉素引起的耳蝸毛細胞毒性的影響，并進一步探討其主要水溶性成分丹酚酸B的療效。

1 材料

1.1 藥物與試劑

丹參(廣東廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號為YPA6A0001)；丹酚酸B對照品(上海歷鼎生物技術有限公司，批號為Z111562)；丹酚酸B(上海歷鼎生物技術有限公司，CAS：115939-25-8)；硫酸慶大霉素(廣東廣州市齊云生物技術有限公司，CAS：405-41-0)；依達拉奉(EDA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：89-25-8)；MTT(美國Sigma公司，CAS：298-93-1)；DASPEI(美國Sigma公司，CAS：3785-01-1)；MS-222(美國Sigma公司，CAS：886-86-2)；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；PBS(美國Gibco公司)；豐年蝦卵(山東濱州市愛家寵物水族用品有限公司)；甲醇(色譜純，美國Dikma公司)；蒸餾水(香港屈臣氏集團有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀(LC-20AT泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20A自動進樣器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；HER Acell 150i培養箱(美國Thermo公司)；SW-CJ-1ED超凈工作臺(江蘇蘇州市蘇凈集團有限公司)；BDS-300顯微鏡(重慶Optec光學儀器有限公司)；RT-2100C酶標儀(深圳Rayto生命科學股份有限公司)；HH-1數顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠)；H1850離心機(湖南湘潭市湘儀儀器有限公司)；BL-220H天平(日本島津公司)；DY04-13-44-00滅菌器筒(上海東亞壓力容器制造有限公司)；Observer A1倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.3 實驗細胞與動物

1.3.1 細胞株 HEI-OC1耳蝸毛細胞，由美國豪斯耳研究所(House Ear Institute，HEI)提供。該細胞株是從永生化小鼠耳蝸Corti器分離培育出來的一種能夠體外傳代培養的毛細胞株[9]。

1.3.2 斑馬魚 野生AB系斑馬魚，由中山大學醫學院惠贈，本實驗室繁育保存。斑馬魚的養殖系統溫度控制在(28±0.5) ℃，光周期為14 h/10 h(光照/黑暗)，水中溶解氧濃度大于5.5 mg/L，pH值7.0～7.5，電導率450～550 μS/cm，飼養管理符合國際AAALAC認證的要求[10]。

2 方法

2.1 丹參提取物的提取

將丹參剪碎后稱取100 g，加入75%(φ)乙醇于90 ℃下加熱回流1 h得到提取液，重復提取至無色為止，合并提取液。常壓蒸餾除去乙醇，收集水溶液再濃縮成浸膏，接著冷凍干燥，于-20 ℃下密封保存。

2.2 丹酚酸B的含量測定

參照本課題組之前研究[11]，建立了丹酚酸B含量測定方法。

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B對照品10 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解15 min，取出冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，過0.22 μm濾膜，即為對照品溶液。

2.2.2 丹參提取物溶液制備 精密稱取丹參提取物凍干粉末20 mg置10 mL容量瓶中，同樣用甲醇溶解和定容至刻度，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即為丹參提取物溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Amethys C18-P 色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水；流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃；檢測波長：286 nm；進樣量：20 μL；梯度洗脫(洗脫程序：0 min，乙腈20%；10 min，乙腈25%；15 min，乙腈25%；30 min，乙腈33%)。

2.3 HEI-OC1細胞體外實驗

2.3.1 細胞培養 HEI-OC1細胞在33 ℃、10%(φ)CO2[12-13]的細胞培養箱中使用10%(φ)胎牛血清的高糖DMEM培養基培養。當細胞長滿后，制備細胞懸液，使用血小板細胞計數法調整HEI-OC1細胞的濃度，以1×105/mL的密度接種于96孔板(100 μL/孔)。

2.3.2 慶大霉素造模 待細胞長至80%后棄去培養液，按順序加入100 μL的基礎培養基(空白組、造模組)，EDA(陽性藥組，40 μmol/L)和丹參提取物(10、100和500 μg/mL)或者丹酚酸B(1、10和100 μg/mL)孵育1 h后，除了對照組均加入同體積的10 mmol/L慶大霉素繼續孵育24 h。

2.3.3 檢測細胞存活率 孵育完成后，吸取出藥液，加入100 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續置于培養箱內孵育4 h。再除去MTT溶液，加入100 μL的 DMSO，使形成的結晶物溶解完全，于490 nm處測量各孔的A值，檢測細胞存活率(n=6)。

2.4 斑馬魚體內實驗

以自然成對交配繁殖方式進行，選擇受精后5～6 dpf的斑馬魚幼魚，隨機分組，將其轉移至96孔板內，每孔3～4尾。

2.4.1 慶大霉素造模 按順序加入100 μL的胚胎培養液(空白組、造模組)，EDA(陽性藥組，46 μmol/L)和丹參提取物(100和500 μg/mL)或者丹酚酸B(50和100 μg/mL)孵育1 h后，除對照組均加入同體積的100 μmol/L慶大霉素繼續孵育1 h。

2.4.2 斑馬魚毛細胞損傷的評價 孵育結束后移除液體，再加入0.005% DASPEI染色15 min，胚胎培養液潤洗3次，加入15 μmol/L的MS-222麻醉5 min，后將其置于熒光顯微鏡下觀察神經丘SO1、SO2、O1、OC1，進行熒光半定量分析，即將強熒光標記為2,弱熒光標記為1，沒有則標記為0，每條魚均統計4個神經丘的熒光強度，各組統計6條魚。

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 丹酚酸B的含量

丹酚酸B對照品和丹參提取物的色譜圖如圖1所示，丹酚酸B作為丹參提取物的主要成分，采用高效液相色譜峰面積歸一化法于286 nm檢測波長下測得丹酚酸B的含量為(50.39±0.33)%，保留時間為16.25 min。

mAU4003002001000mAU4003002001000102030011ABt/min

圖1丹酚酸B對照品(A)和丹參提取物(B)的HPLC色譜圖

Figure1HPLC chromatograms of Sal B (A) and sample (B)

3.2 丹參提取物對慶大霉素耳毒性的保護作用

3.2.1 丹參提取物對慶大霉素損傷HEI-OC1細胞的保護作用 如圖2所示，造模組細胞的細胞存活率約50%，顯著低于空白組(P<0.01)，表明模型建立成功；陽性對照藥EDA處理后細胞的存活率明顯高于造模組(P<0.05)，差異有顯著統計學意義，說明EDA可有效保護HEI-OC1細胞。丹參提取物10、100和500 μg/mL組與造模組相比，10、100 μg/mL的丹參提取物差異無統計學意義，但它們呈線性遞增的趨勢，500 μg/mL組差異有統計學意義(P<0.01)，說明500 μg/mL的丹參提取物可防護慶大霉素致HEI-OC1細胞損傷。

3.2.2 丹參提取物對慶大霉素損傷斑馬魚毛細胞的保護作用 如圖3所示，造模組側線毛細胞的存活率約50%，顯著低于空白組(P<0.01)，表明模型建立成功；EDA處理后細胞的存活率顯著大于造模組(P<0.01)，差異具有統計學意義，說明EDA可明顯保護斑馬魚毛細胞。丹參提取物100和500 μg/mL組與造模組相比，500 μg/mL組差異有統計學意義(P<0.01)，說明500 μg/mL的丹參提取物能預防慶大霉素致斑馬魚毛細胞損傷。

3.3 丹酚酸B對慶大霉素耳毒性的保護作用

3.3.1 丹酚酸B對慶大霉素損傷HEI-OC1細胞的保護作用 如圖4所示，在同樣的模型上，丹酚酸B 1、10和100 μg/mL組與造模組相比，100 μg/mL組差異有統計學意義(P<0.01)，說明100 μg/mL的丹酚酸B可防護慶大霉素致HEI-OC1細胞損傷。

3.3.2 丹酚酸B對慶大霉素損傷斑馬魚毛細胞的保護作用 如圖5所示，在相同的斑馬魚模型中，丹酚酸B 50和100 μg/mL組與造模組相比，差異均無統計學意義(P>0.05)，說明丹酚酸B直接用于斑馬魚耳毒性模型不能發揮保護作用。

120100806040200細胞存活率/%123456##***

1.空白組； 2.造模組； 3.EDA組； 4.丹參提取物 10 μg/mL； 5.丹參提取物 100 μg/mL； 6.丹參提取物 500 μg/mL； 與空白組比較：##P<0.01； 與造模組比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖2丹參提取物對慶大霉素損傷HEI-OC1細胞的保護作用

Figure2Protective effect of Salvia miltiorrhiza extract on gentamicin-induced HEI-OC1 cell injury (n=6)

1.空白組； 2.造模組； 3.EDA組； 4.丹參提取物 100 μg/mL； 5.丹參提取物 500 μg/mL； 與空白組比較：##P<0.01；與造模組比較：**P<0.01。

圖3丹參提取物對慶大霉素損傷斑馬魚毛細胞保護作用

Figure3Protective effect of Salvia miltiorrhiza extract on genta-micin-induced zebrafish hair cell injury (100×,n=6)

123456120100806040200細胞存活率/%##****

1.空白組； 2.造模組； 3.EDA組； 4.丹酚酸B 1 μg/mL； 5.丹酚酸B 10 μg/mL； 6.丹酚酸B 100 μg/mL；與空白組比較：##P<0.01；與造模組比較：**P<0.01。

圖4丹酚酸B對慶大霉素損傷HEI-OC1細胞的保護作用

Figure4Protective effect of Sal B on gentamicin-induced HEI-OC1 cell injury (n=6)

1.空白組； 2.造模組； 3.EDA組； 4.丹酚酸B 50 μg/mL； 5.丹酚酸B 100 μg/mL； 與空白組比較：##P<0.01；與造模組比較：**P<0.01。

圖5丹酚酸B對慶大霉素損傷斑馬魚毛細胞保護作用

Figure5Protective effect of Sal B on gentamicin-induced zebrafish hair cell injury (100×,n=6)

4 討論

HEI-OC1細胞株能表達多種耳蝸毛細胞標志蛋白，常被作為耳毒性模型用于研究耳蝸毛細胞的損傷和保護機制[14]，所以本研究選擇HEI-OC1細胞株作為藥源性聾的體外模型。斑馬魚和人類基因有著87%的高度同源性，具有與人類相似的內耳結構和毛細胞[15]。近年來斑馬魚模型被廣泛用于耳毒性模型篩選藥物、毛細胞發育、損傷、再生等研究[16]，故選擇其作為研究藥源性聾的體內模型。此外，預試發現不同模型對藥物的耐受性不同，因此本研究選擇丹參提取物和丹酚酸B的濃度也不一樣，并通過體內外模型發現了丹參提取物對慶大霉素引起的耳毒性具有保護作用。

慶大霉素是氨基糖苷類抗生素，廣泛用于治療革蘭陰性菌引起的感染，但其易聚集于耳蝸毛細胞中的線粒體和溶酶體，增加細胞內氧自由基活動，產生嚴重的耳毒性[17]，所以本研究選擇其作為藥源性聾的造模藥物。大量數據證明，幾乎所有耳毒性藥物、噪音、衰老引起的內耳細胞死亡都與氧化應激引起過剩自由基的破壞有關[18]。因此，丹參提取物除了對藥源性聾有保護作用，可能對噪聲性、老年性聾也有保護作用，有待進一步證實。

從結果可知，丹參提取物能有效預防慶大霉素的耳毒性，作為丹參提取物主成分的丹酚酸B也能有效防治慶大霉素導致的HEI-OC1細胞損傷，但對慶大霉素導致的斑馬魚毛細胞損傷沒有保護作用。從分子結構上看，丹酚酸B是由三分子丹參素和一分子咖啡酸二聚體以酯鍵縮合而成的低聚物，具有2個羧基與7個酚羥基，是丹酚酸B清除自由基和抗氧化作用的主要活性基團[19]。但其在體內不穩定，可發生甲基化、呋喃環開環和酯鍵水解反應等[20]，產生甲基化產物、紫草酸、丹參素和丹酚酸 A、S、T、J等降解產物[21]。從各個降解物的分子結構而言，它們雖然至少含有1個酚羥基、羧基或者醛基[22-23]，但抗氧化能力沒有丹酚酸B強而不能對慶大霉素引起的耳毒性產生較好的保護作用。此外，丹酚酸B的不穩定性導致了其在機體內的快速吸收、分布、代謝和消除，生物利用度低、作用時間短和易降解等缺點，制約了在臨床的應用。因此，可考慮對丹酚酸B進行結構修飾得到更穩定的前藥，或者進行劑型改造來克服這些缺點，為其在預防慶大霉素引起的耳毒性的廣泛應用奠定基礎，有望將其進一步開發成為耳毒性保護藥。丹酚酸B及其體內降解物的結構見圖6。

A.丹酚酸B； B.3-甲基丹酚酸B； C. 3,3″-二甲基丹酚酸B； D. 3,3?-二甲基丹酚酸B； E.3,3″,3?-三甲基丹酚酸B； F.紫草酸； G.丹酚酸A； H.丹酚酸S； I.丹酚酸T； J.丹酚酸J； K.丹參素。

圖6丹酚酸B及其體內降解物的結構

Figure6Structure of salvianolic acid B and its degradation productsinvivo