分子對接技術預測丹酚酸B對TGF-β/Smads信號通路的潛在作用靶點

曾煦欣,郭嘉亮,劉妙玲,王芳,尹雅祺,趙志雄

(1.佛山科學技術學院醫(yī)藥工程學院，廣東 佛山 528000； 2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)是丹參的主要有效水溶性成分，具有抗肝、腎、肺等臟器纖維化作用[1-3]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)SAB可抑制TGF-β1誘導黏連組織成纖維細胞增殖和ECM合成，提示SAB具有減少腹部手術后臟器間纖維化黏連的作用[4]。研究顯示，內(nèi)皮細胞、間皮細胞等功能性細胞發(fā)生上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)沉積是產(chǎn)生各類纖維化疾病的主要原因，TGF-β/Smads信號通路可介導EMT發(fā)生與ECM沉積[5]。為此，本文以TGF-β/Smads信號通路及其參與介導EMT過程的蛋白為研究對象，通過構建蛋白結(jié)構數(shù)據(jù)集，采用反向分子對接技術尋找SAB在影響上述信號通路中潛在的靶點結(jié)合蛋白，為進一步闡明SAB對纖維化疾病的作用機制提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 軟件

分子可視化軟件Chimera 1.11.2，分子結(jié)構繪制軟件ChemBiodraw Ultra 12.0與ChemBio3D Ultra 12.0，分子對接軟件 Autodock Vina 1.1.2與PyRx 0.8。

1.2 構建TGF-β/Smads信號通路靶點結(jié)構數(shù)據(jù)集

通過文獻[5-7]查找TGF-β/Smads信號通路以及EMT的信息，通過PDB蛋白結(jié)構數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)檢索通路中各個靶點蛋白的相關結(jié)構，按照以下原則篩選出相關蛋白-小分子復合物結(jié)構，構建信號通路靶點結(jié)構數(shù)據(jù)集。有效靶點復合物結(jié)構篩選原則：(1)靶點為蛋白結(jié)構；(2)來源于homosapiens(人源)；(3)蛋白結(jié)構只允許是X-衍射晶體結(jié)構；(4)具有有效的結(jié)合小分子配體，不包含金屬離子、溶劑殘留物、多肽、糖苷等。

由于一個靶點可能存在多個符合篩選原則的復合物結(jié)構，故采用以下優(yōu)先原則挑選復合物結(jié)構：(1)優(yōu)先選擇分辨率高的結(jié)構；(2)同種靶點復合物結(jié)構上限5個，盡可能找到足夠多的復合物結(jié)構，以提高對接的結(jié)果準確度；(3)來源于不同文獻且配體結(jié)構差異較大的結(jié)構；(4)若需要從同一文獻挑選不同結(jié)構，則優(yōu)先選擇分辨率較高的。

1.3 SAB的前處理

使用ChemBioDraw Ultra 12.0 軟件繪制SAB的分子結(jié)構式，再使用ChemBio3D Ultra 12.0軟件將其轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構并進行簡單的MM2 能量優(yōu)化。

1.4 反向分子對接的準備

1.5 反向分子對接的批量處理

反向分子對接需要將同一配體對接到不同蛋白來實現(xiàn)，由于通路靶點蛋白結(jié)構數(shù)據(jù)集中的蛋白數(shù)量較多，因此通過編寫B(tài)ash腳本實現(xiàn)反向分子自動反向?qū)印１狙芯渴褂玫姆聪蚍肿訉幽_本命名為multi_vina.sh，在運行中會另外生成2個核心腳本：vina_conf.py、get_result.py，3個腳本的用途如下：

(1)multi_vina.sh：執(zhí)行多個靶點結(jié)構的分子對接批處理，需要和所有經(jīng)過預處理的蛋白結(jié)構pdbqt文件放在一起；

(2)vina_conf.py：計算蛋白原有配體結(jié)構的幾何中心，并用該中心定義蛋白的結(jié)合口袋，盒子的邊長x，y，z均為默認的25 nm，最終生成vina的參數(shù)文件；

(3)get_result.py：分析對接結(jié)果中最優(yōu)對接構象的親合力得分，并輸出到finish_result.csv文件，便于后續(xù)分析。

將所有經(jīng)PyRx預處理的蛋白結(jié)構pdbqt文件、原有配體的mol2文件和SAB結(jié)構pdbqt文件置于同一文件夾中，執(zhí)行multi_vina.sh腳本，進行自動反向?qū)印Ｔ趯咏Y(jié)果中，只提取最優(yōu)構象的預測結(jié)合親合力分數(shù)作為結(jié)果。然后導出所有最優(yōu)構象的親合力分數(shù)結(jié)果，進行排序，找到潛在的親合力最強的結(jié)合靶點。

1.6 反向?qū)咏Y(jié)果的可視化分析

將反向?qū)拥慕Y(jié)果用Chimera的ViewDock模塊打開，可以分析其對接構象以及對應的結(jié)合親合力。通過進一步考察對接構象5 nm范圍內(nèi)的鄰近蛋白殘基，并結(jié)合Chimera的Find H-bond模塊，對SAB和結(jié)合蛋白的相互作用進行分析。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β/Smads通路靶點蛋白復合物結(jié)構數(shù)據(jù)集

通過文獻搜索出與TGF-β/Smads信號通路相關的蛋白[8-12]，分別是： ID2/3、E12/E47、E2A、Slug、SARA、SIP1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad6、Smad6/7、Smad7、Snail、Twist、CBP/p300、SMIF、Smurf1、Smurf2、MSG1、ARC105、Evi1、TGIF、RUNX、Fox、Ski/SnoN、E3、AP-1、TRAP1、Axin、GRB2、SOS、TMEPAI、CTBP、GIPC。根據(jù)方法“1.2”中規(guī)定的有效靶點復合物結(jié)構篩選原則進行分類，結(jié)果如下：

(1)無X-衍射晶體結(jié)構的蛋白：Evil、ARC105,共2個；

系統(tǒng)工程助推新時代的強國夢....................................................................................................................................................薛惠鋒（1）

(2)無蛋白結(jié)構存在或結(jié)構不來源于人類的蛋白：Smad6/7、MSG1、Slug、Ski/SnoN、TMEPAI，共5個；

(3)無天然配體存在的蛋白：Smad2、Smad3、Smad4、Smad6、Smad7、SARA、GIPC、SIP1、TGIF、SMIF、RUNX、Smurf1、Smurf2、E12/E47，共14個；

(4)符合篩選條件的蛋白：CBP/p300、E2A、Fox、ID2/3、Snail、Twist、E3、AP-1、CTBP、TRAP1、Axin、GRB2、SOS，共13個。

在PDB結(jié)構數(shù)據(jù)庫搜索符合篩選條件的13個潛在靶點蛋白結(jié)構，搜索出合乎復合物篩選原則的靶點蛋白結(jié)構共52個，所有符合標準的靶點蛋白的相關信息如表1所示。

2.2 反向?qū)哟蚍纸Y(jié)果

Autodock Vina主要是以預測得分作為親合力大小的標準，預測得分越小親合力越大，暗示兩者結(jié)合更容易發(fā)生。自動對接完畢后整理數(shù)據(jù)，由于其中3個結(jié)構存在質(zhì)量問題無法成功對接，實際進行實驗對接結(jié)果為49個。表2為每個靶點蛋白與SAB的對接打分結(jié)果。

2.3 對接結(jié)果分析

通過表2得分數(shù)據(jù)比較，分數(shù)越低對接構象親和力越好，其中2x39和2y48得分均為-10.9，為潛在的最優(yōu)結(jié)合蛋白。利用Chimera對以上2個得分最佳的結(jié)構進行構象檢視比較，結(jié)果如圖1所示，其中SAB可旋轉(zhuǎn)鍵中的O_25與2x39殘基GLY(295.A)上酰胺鍵的NH之間只有1個氫鍵作用；SAB可旋轉(zhuǎn)鍵中的酚羥基氧原子分別與2y48的殘基VAL(333.A)、MET(332.A)上酰胺鍵的NH產(chǎn)生氫鍵作用，另外一個殘基THR(335.A)上的NH則與SAB可旋轉(zhuǎn)鍵上的酚羥基氧原子產(chǎn)生氫鍵作用，共存在3個氫鍵相互作用。

表1 TGF-β/Smads通路靶點蛋白數(shù)據(jù)集信息

Table1Protein data information in in the TGFF-βSmads target dataset

序號蛋白名稱及編號PDB代碼序號蛋白名稱及編號PDB代碼1AP-1-12bzz27GRB2-43l8v2AP-1-25kfz28GRB2-53zxz3Axin-12jdo29HDAC4/5-12vqm4Axin-22x3930HDAC4/5-34cbt5Axin-35c5p31HDAC4/5-44cby6Axin-45c5q32HDAC4/5-55a2s7Axin-55c5r33ID2/3-11f5n8CBP/p300-23biy34ID2/3-21nn09CBP/p300-25fdz35Snail-12y4810CBP/p300-35j0d36Snail-25afh11CBP/p300-45lvq37Snail-35afj12E2A-13ibd38Snail-45afk13E2A-23qoa39Snail-55afm14E3-12yk940SOS-14epv15E3-24ogn41SOS-24luc16E3-34wt242SOS-34lv617E3-44ybm43SOS-44lyh18E3-55c5a44SOS-54lyj19Fox-14qo445SOS-64m1y20Fox-24wt246TRAP1-14z1f21Fox-34zka47TRAP1-24z1g22Fox-45ec948TRAP1-34z1h23Fox-55l4q49TRAP1-45f5r24GRB2-12wkm50TRAP1-55hph25GRB2-23imd51Twist-13ff626GRB2-33kfj52Twist-24hib

表2 應用AutoDock Vina對接后的打分結(jié)果匯總

Table2Summary of scoring results after docking with AutoDock Vina

序號PDB代碼蛋白類型得分序號PDB代碼蛋白類型得分12x39Axin-10.9264wt2E3/Fox-7.922y48Snail-10.9275lvrCBP/p300-7.933ibdE2A-10.2285f5rTRAP1-7.845c5pAxin-10.1293kfjGRB2-7.752jdoAxin-9.7303l8vGRB2/SHC-7.765c5qAxin-9.6315lvqCBP/p300-7.773qoaE2A-9.4321f5nID2/3-7.681nn0ID2/3-9.3335fdzCBP/p300-7.692wkmGRB2-9.3344ybmE3-7.4103zxzGRB2-9.3355afjSnail-7.4113biyCBP/p300-9.1364qo4Fox-7.2124lv6SOS-8.9374epvSOS-7

表2 (續(xù))

A. 2x39(Axin)； B. 2y48(Snail)。

圖1丹酚酸B與潛在靶點結(jié)合的對接結(jié)構

Figure1Docking structure of Salvianolic acid B binding to potential target proteins

3 討論

3.1 SAB結(jié)構及其在TGF-β/Smads通路中潛在靶點的作用分析

SAB的結(jié)構中含有2個羧基，多個酚羥基，以及4個苯環(huán)。其中的羥基可作為氫鍵的供體或受體，跟靶點蛋白良好地結(jié)合，SAB與2y48、2x39的對接構象檢視結(jié)果印證了這一點，故SAB本身的結(jié)構條件具備做分子對接的價值。

氫鍵作用、靜電力作用、范德華力作用是判斷配體-受體分子間相互作用的重要指標，通過綜合AutoDockVina對結(jié)合能的評分結(jié)果以及利用Chimera檢視配體與受體結(jié)合后氫鍵的形成的位置和數(shù)量比較，可以簡單判斷出最佳的蛋白結(jié)構序列為2y48，其次是與其同分的2x39。其中2y48所屬蛋白為Snail，2x39屬于Axin，因此Snail作為SAB靶點的可能性最高，Axin次之。

此外，通過分析總體得分情況，發(fā)現(xiàn)Axin蛋白結(jié)構不僅得到-10.9的對接分數(shù)，而且共有3個結(jié)構得分排名在前10，分別為-10.1、-9.7、-9.6。而反觀Snail類型的蛋白結(jié)構大多數(shù)得分不理想。據(jù)此推測Axin蛋白作為SAB的靶點可能性更高。

3.2 SAB與Snail結(jié)合調(diào)控TGF-β/Smads信號傳導的機制預測

在EMT過程中，鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Snail是啟動基因重新編輯的主要轉(zhuǎn)錄因子，與堿性螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Twist)和鋅指E-盒結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子(ZEB)共同調(diào)控EMT靶基因轉(zhuǎn)錄[5]。在Snail1的Twist聯(lián)合作用下，E-鈣黏連蛋白表達抑制，N-鈣黏連蛋白表達增強[8-9]。Snail1與Twist也可共同誘導ZEB1表達，使ZEB發(fā)揮抑制上皮連接和極性基因、激活間充質(zhì)基因的作用[10-11]。

另一方面，TGF-β信號主要傳導蛋白Smads復合物也與Snail共同促進EMT發(fā)生。TGF-β通過Smad3依賴的轉(zhuǎn)錄誘導Snail1表達，Snail1與Smad3-Smad4復合物相互協(xié)作，使編碼E-鈣黏連蛋白和閉鎖蛋白基因抑制的信號繼續(xù)向下游傳遞，抑制或活化EMT靶基因，最終導致上皮細胞標記物表達降低，間充質(zhì)細胞標記物表達增多[12-13]。

由此推斷，SAB通過與Snail結(jié)合，使Smad信號誘導表達的Snail失效，切斷抑制E-鈣黏連蛋白表達以及激活間充質(zhì)細胞標記蛋白表達的信號傳導，從而干擾EMT進程，產(chǎn)生抗纖維化的作用。

3.3 SAB與Axin結(jié)合調(diào)控TGF-β/Smads信號傳導的機制預測

體軸發(fā)育抑制因子(Axis inhibitor，Axin)是一種起著支架蛋白作用的多功能蛋白，有2個同源蛋白Axin1和Axin2，主要參與控制細胞生長分化、細胞癌變與凋亡等過程[14]。Axin通過泛素E3鏈接酶(Arkadia)與Smad7形成復合物，促進Smad7泛素化而降解Smad7。由于Smad7負責拮抗Smads信號轉(zhuǎn)導，因此Axin對Smad7的降解可促進TGF-β/Smad信號傳遞[15]。TGF-β受體活化后，Smad3在Axin的作用下與TGF-βⅠ型受體(TβRI)結(jié)合，以更高的效率磷酸化，隨后脫離Axin與受體釋放出來，說明Axin通過增強Smad3活化促進TGF-β/Smad信號傳遞。進一步實驗也證明Axin可增強TGF-β的轉(zhuǎn)錄活性[16-17]。據(jù)此推測與SAB結(jié)合能改變Axin的結(jié)構及生物活性，致使其不能催化Smad3磷酸化過程，也不能誘導Smad7降解，從而干擾TGF-β信號傳導。

綜上所述，SAB對TGF-β/Smad信號通路的作用靶點極有可能是Snail與Axin，SAB通過與這2個因子結(jié)合干擾TGF-β信號傳導，進而抑制纖維化的發(fā)生。為證實上述推測，今后將通過基因與蛋白檢測、SAB與靶蛋白體外結(jié)合等實驗作進一步的驗證，也計劃采用相同的實驗體系繼續(xù)研究SAB對其他TGF-β信號通路(如MAPKs、PI3K等)的作用，不斷完善SAB抗纖維化疾病的機制。