產纖維素酶細菌的分離、鑒定與酶學性質研究

梁倩，李荷，王卓婭

(廣東藥科大學 1.生命科學與生物制藥學院； 2.藥學院，廣東 廣州 510006)

作為植物光合作用的主要產物，纖維素是自然界含量最多、分布最廣、最易得的可再生有機資源[1-2]。遺憾的是，除少量用于堆肥外，大部分纖維素資源被直接丟棄或就地焚燒，不僅未能得到有效利用，而且對環境造成污染[3-4]。纖維素的開發利用，對于解決目前人類面臨的環境污染和資源衰竭危機，均具有十分重要的意義[5-6]。

纖維素結構的難以破壞性，是實現纖維素資源有效利用的最大壁壘[7]。通過微生物產生的纖維素酶催化降解纖維素，是纖維素處理最為經濟環保的方法[8-10]。篩選纖維素酶高產菌株，降低高效纖維素酶生產成本，則有望從源頭解決纖維素資源的開發利用難題。本研究從中藥堆肥渣和黑龍江玉米地樣本中，篩選高產纖維素酶菌株，對其進行分子生物學鑒定和酶學性質分析，以期為纖維素酶制劑研制或基因工程菌株的構建提供基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品

廣州涼茶中藥渣堆肥，黑龍江玉米地地下8 cm土壤。

1.2 試劑

葡萄糖標準品、羧甲基纖維素鈉(sodium salt of carboxyl methyl cellulose，CMC-Na)等常規試劑均為國產分析純；胰蛋白胨、酵母提取粉、瓊脂粉購于Coolaber公司；2×TSINGKE Master Mix、瓊脂糖、微生物基因組DNA提取試劑盒購于Tsingke公司。

1.3 培養基

初篩培養基(CMC-Na固體培養基，200 mL)：蛋白胨2 g，酵母粉2 g，CMC-Na 2 g，NaCl 1 g，KH2PO40.2 g，瓊脂粉3 g，121 ℃高壓滅菌20 min。剛果紅鑒別培養基(200 mL)：(NH4)2SO40.4 g，MgSO40.1 g，K2HPO40.2 g，NaCl 0.1 g、CMC-Na 4 g，剛果紅0.08 g，瓊脂粉3 g，121 ℃高壓滅菌20 min。復篩培養基(CMC-Na液體培養基)：CMC-Na固體培養基不加瓊脂粉。

1.4 樣品處理

稱取樣品10 g，加入到盛有90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，充分打散混勻后，置于28 ℃恒溫搖床180 r/min震蕩20 min，得10-1稀釋菌液。無菌操作吸取100 μL 10-1稀釋菌液至盛有900 μL無菌水的1.5 mL EP管中，吹打混勻得10-2稀釋菌液。照此方法依次制備10-3和10-4濃度稀釋菌液。

1.5 初篩

吸取10-2、10-3、10-43個梯度的稀釋菌液100 μL，分別涂布于CMC-Na固體培養基上，每個稀釋度設3個重復。28 ℃恒溫倒置培養，每天觀察挑選，將長出的較大菌落點種于剛果紅固體培養基上，培養3～10 d觀察有無水解圈形成。

1.6 純化和復篩

有水解圈形成的菌落，經重復劃線分離得單菌落。觀察單菌落形態大小，將目測為不同菌種的單菌落，分別點種于CMC-Na固體初篩培養基，每個菌種重復點種3個點。28 ℃恒溫培養5 d后，每培養皿加入1 mg/mL剛果紅染色液15 mL，染色1 h后棄去染液，加入1 mol/L NaCl水溶液15 mL脫色1 h。測量菌落直徑(d)，水解圈直徑(D)，并計算D/d值。

1.7 纖維素酶酶活測定

將復篩獲得的較優菌株接種于5 mL復篩液體培養基中，28 ℃ 180 r/min振蕩培養5 d，測定各菌株的纖維素酶活力，每組酶活力重復測定3次取平均值。3,5-二硝基水楊酸法(3,5-Dinitro salicylic acid,DNS)葡萄糖標準曲線的繪制方法、羧甲基纖維素酶(carboxymethylcellulase，CMCase)的酶活測定方法、濾紙纖維素酶(filter paper cellulase，FPase)的酶活測定方法，以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，βGase)的酶活測定方法見參考文獻[11]。

1.8 分離菌株的16S rDNA序列分析與鑒定

待鑒定菌株于CMC-Na液體中培養過夜后，使用微生物基因組DNA提取試劑盒提取基因組總DNA為模板，采用27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3′)引物擴增16S rDNA序列，PCR擴增體系和反應條件見參考文獻[12]。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，若大小與預期結果相符，送廣州擎科生物技術有限公司測序。經雙相測序拼接所得結果，在NCBI上進行Blast相似性搜索，獲取近似典型菌株基因序列，進行菌種鑒定，同時使用MEGA 5.0 軟件生成系統發育進化樹。

1.9 分離菌株所產纖維素酶性質分析

溫度對酶學活性及穩定性的影響：測定下列溫度條件下(4 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)粗酶液的酶學活性和穩定性。所有反應均在pH4.8條件下進行，具體實驗方法見參考文獻[13]。

pH值對酶學活性及穩定性的影響：在50 ℃條件下，測定pH 2～11反應體系中粗酶液的酶學活性和穩定性，具體實驗方法見參考文獻[13]。

不同金屬離子對酶學活性的影響：將粗酶液經2個濃度(1、10 mmol/L)的11種金屬離子(Ca2+、Cu2+、Hg2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Ni2+以及Li+)處理4 h后，50 ℃條件下測定其酶學活性，以未處理粗酶液為100%參照。

不同有機溶劑對酶學活性的影響：將粗酶液經3個濃度(1%、15%、30%)的5種有機溶劑(甲醇、乙醇、異丙醇、DMSO、Triton X-100)處理4 h后，50 ℃條件下測定其酶學活性，以未處理粗酶液為100%參照。

耐鹽性研究：將粗酶液經6 個濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L)鈉鹽處理4 h后，50 ℃條件下測定其酶學活性，以未處理粗酶液為100%參照。

2 結果

2.1 產纖維素酶菌株的獲得與酶活測定

篩選獲得纖維素酶高產菌株3株，分別命名為Z-1、Z-2和H-3。3菌株的菌落形態與剛果紅水解圈結果如圖1所示，菌落直徑(d)、剛果紅透明圈直徑(D)與D/d值見表1。

圖1Z-1、Z-2、H-3菌株的菌落形態及剛果紅水解圈

Figure1Colonial morphologies and Congo red transparent circles of Z-1,Z-2 and H-3 strains

以不同含量葡萄糖為橫坐標，其570 nm處的吸光度值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，R2為0.999 4，線性擬合良好(圖2)。CMC-Na液體培養基培養5 d后的酶學活性見表2，其中H-3菌株CMCase酶學活性高達(1 538.44±16.49) U/mL。

表1 Z-1、Z-2、H-3菌株在CMC-Na固體培養基上的菌落直徑、剛果紅透明圈直徑及比值

Table1Colony diameters,Congo red transparent circle and their ratios of Z-1,Z-2 and H-3 strain

菌株編碼采集處清晰度d/cmD/cmD/dZ-1中藥渣清晰3.435.431.58Z-2中藥渣清晰1.834.862.66H-3黑龍江土壤清晰2.154.882.27

1.00.80.60.40.20.00.00.40.81.21.62.02.42.8葡萄糖含量/mgAY=0.2804X-0.006583R2=0.9994

圖2葡萄糖標準曲線

Figure2Glucose standard curve

表2 各菌株在CMC-Na液體培養基培養5 d的酶學活性

Table2Enzymatic activity of three strains in 5-d CMC-Na culture

菌株編碼CMCase/(U·mL-1)FPase /(U·mL-1)βGase/(U·mL-1)Z-1977.92±17.97128.38±11.8952.06±7.14Z-21 089.79±7.43191.15±7.9376.46±5.74H-31 538.44±16.49212.87±8.8186.58±8.98

2.2 菌株的基因鑒定

提取Z-1、Z-2、H-3基因組DNA，分別擴增16S rDNA區域，并對PCR產物電泳檢測，發現1 600 bp附近可觀察到清晰條帶(圖3)。將3菌株16S rDNA序列在Gen-bank中作同源性檢索分析，發現與已注冊參考菌株16S rDNA序列同源性高于99%，H-3和Z-2菌株鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，Z-1菌株鑒定為甲基營養型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)(圖4)。

2.3 最佳發酵時間測定

H-3和Z-1菌株最佳發酵時間為5 d，Z-2菌株最佳發酵時間為7 d(圖5)。

1234520001000750500250100bp1. DNA marker; 2. 陰性對照; 3. H-3; 4. Z-2; 5. Z-1。圖3 Z-1、Z-2、和H-3菌株的16S rDNA PCR擴增圖Figure 3 Electrophoresis for 16S rDNA amplification of Z-1,Z-2 and H-3 strains

Bacillusvallismortis(AB021198)Bacillussiamensis(GQ281299)Bacillusmethylotrophicus(LLZC01000010)Z-1Bacillussubtilissubsp.InaquosorumKCTC13429(AMXN01000021)Bacillussubtilis(AJ276351)H-3Z-2Bacillustequilensis(HQ223107)Bacillussubtilissubsp.spizizenii(AF074970)Bacillushalotolerans(DQ993671)Bacillusmojavensis(AB021191)0.002Bacillusgobiensis(KF995513)

圖4Z-1、Z-2、和H-3菌株的16S rDNA系統發育樹

Figure4Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of Z-1,Z-2 and H-3 strains

100806040200CMC-Na相對酶活/%1002468培養天數/dZ-2菌株H-3菌株Z-1菌株

圖5酶活隨菌株培養天數的變化曲線

Figure5Change curve of enzyme activity with the number of days of strain culture

2.4 溫度對菌株所產纖維素酶活性及穩定性的影響

pH4.8反應條件下，3株菌株所產纖維素酶的最適溫度均為50 ℃。50 ℃熱處理4 h后，相對剩余酶活均保持在50%以上(圖6)。

2.5 酸堿度對菌株所產纖維素酶活性及穩定性的影響

Z-1菌株所產纖維素酶最適pH值為pH4，H-3和Z-2菌株所產纖維素酶的最適pH值為pH5；pH 4～6之間時，H-3和Z-2菌株所產纖維素酶經4 h處理后，酶活反而升高，最高為122%(圖7)。

2.6 金屬離子對菌株所產纖維素酶活性的影響

10 mmol/L Ag+離子對3株菌株所產纖維素酶活性均表現出顯著的激活作用；1 mmol/L Co2+離子和1 mmol/L Mg2+離子對Z-2菌株所產纖維素酶活性有顯著激活作用，1 mmol/L Fe2+離子對H-3菌株所產纖維素酶活性具有顯著激活作用；10 mmol/L Hg2+離子和10 mmol/L Mn2+離子則對H-3和Z-2菌株所產纖維素酶活性表現出顯著抑制作用(圖8)。

2.7 有機溶劑對菌株所產纖維素酶活性的影響

Tris-100對3株菌株所產纖維素酶活性均表現出顯著的激活作用；低濃度甲醇和DMSO對Z-1和Z-2菌株所產纖維素酶活性表現出顯著激活作用；而高濃度的甲醇、乙醇和異丙醇，則對3株菌株所產纖維素酶活性表現出強烈抑制作用(圖9)。

相對酶活/%100806040200204060800θ/℃204060800θ/℃204060800θ/℃H-3Z-1Z-2溫度穩定性最適溫度100806040200100806040200

圖6溫度對菌株所產纖維素酶活性及穩定性的影響

Figure6Effect of temperature on enzyme activity and stability

H-3Z-1Z-2相對酶活/%1201008060402000246810pH0246810pH0246810pHpH穩定性最適pH120100806040200120100806040200

圖7pH對粗酶液的酶學性質影響

Figure7Effect of pH on enzymatic properties of crude enzyme solution

H-3Z-1Z-2相對酶活/%16012080400Ca2+Cu2+Hg2+Fe2+Co2+Mg2+Li+Zn2+Ni2+Ag+Mn2+金屬離子24020016012080400160120804001mmol/oL10mmol/oLCa2+Cu2+Hg2+Fe2+Co2+Mg2+Li+Zn2+Ni2+Ag+Mn2+金屬離子Ca2+Cu2+Hg2+Fe2+Co2+Mg2+Li+Zn2+Ni2+Ag+Mn2+金屬離子

圖8金屬離子對粗酶液的酶學性質影響

Figure8Effect of metallic ions on enzymatic properties of crude enzyme solution

H-3Z-1Z-21%15%30%相對酶活/%140120100806040200Tris-100DMSO異丙醇乙醇甲醇有機溶劑(V/V)Tris-100DMSO異丙醇乙醇甲醇有機溶劑(V/V)Tris-100DMSO異丙醇乙醇甲醇有機溶劑(V/V)140120100806040200140120100806040200

圖9有機溶劑對粗酶液的酶學性質影響

Figure9Effect of organic solvents on enzymatic properties of crude enzyme solution

2.8 鹽濃度對菌株所產纖維素酶活性的影響

H-3和Z-1菌株所產纖維素酶在NaCl濃度為2.5 mol/L時，酶活力保留54%以上；Z-2菌株所產纖維素酶在NaCl濃度為1.5 mol/L時，酶活力保留56.34%，之后隨著NaCl濃度的升高，酶活力急劇下降(圖10)。

c(鈉鹽)/(mol?L-1)100806040200CMC-Na相對酶活/%H-3菌株Z-1菌株Z-2菌株0.00.51.01.52.02.5

圖10粗酶液的耐鹽性

Figure10Salt tolerance of crude enzyme solution

3 討論

產纖維素酶的菌種很多，細菌由于所產纖維素酶的酶活不及真菌高，在過去未能得到太多關注，之前的研究較多集中在木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)等真菌上[9-10,12,14-15]。近年來，對產纖維素酶細菌的研究日益受到重視[8,13]，這一方面是由于細菌所產纖維素酶具有發酵時間短，發酵條件易于控制，酸堿耐受性強，最適反應溫度范圍廣等優點。另一方面則由于污物纖維素類的分解大多在缺氧環境下進行，不利于真菌生長。

堆肥中，秸稈的降解離不開纖維素酶的參與[16]，因此，本研究以廣州涼茶中藥渣堆肥為篩選樣本之一。選取黑龍江玉米地土壤為篩選樣本，則是由于微生物資源最為豐富的土壤環境，是纖維素酶高產菌株的重要來源[17]。

16S rDNA基因序列分析鑒定發現，3株菌均為芽孢桿菌。芽孢桿菌為目前研究最多的產纖維素酶細菌[6,18-21]，其中，吳文韜等[6]2013年獲得的枯草芽孢桿菌，以及吳自祥等[21]2017年獲得的解淀粉芽孢桿菌(P.amyloliquefaciens)表現出較高的纖維素酶活性，CMCase酶學活性分別為153.84 U/mL和240.31 U/mL。與國內報道的這些高酶活菌株相比，H-3、Z-1和Z-2所產纖維素酶活性更高，其中H-3菌株CMCase酶學活性高達1 538.44 U/mL，對其進行優化和誘導，進一步提高纖維素酶活力，具有較高的理論價值和較好的應用前景。

對3株菌株所產纖維素酶的酶學性質分析發現，所產纖維素酶均耐熱、耐酸、耐鹽，H-3和Z-1菌株所產纖維素酶對有機溶劑亦表現出一定的耐受性，這些特征有利于纖維素酶的工業化生產和使用。此外，3株菌株所產纖維素酶可被Ag+、Co2+等金屬離子激活的特點，則可用于酶學活性的提高。

下一步將進一步優化菌株發酵工藝，同時篩選并克隆纖維素酶相關基因，進行基因工程菌的構建。