人防御素2和酸性成纖維因子1融合蛋白hBD2-haFGF1的構建、表達及生物信息學分析

劉文彬，吳立蓉，汪潔，李小波，植奇升

(1.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006； 2.廣州新海醫院檢驗科，廣東 廣州 510300)

人β防衛素-2(human β defensin-2,hBD-2)是一種來源于皮膚、呼吸道等上皮組織的陽離子抗菌肽[1]。hBD-2在皮膚天然免疫中發揮了重要的作用，當皮膚發生細菌感染或者炎癥時，可通過NF-κb通路和絲裂原活化蛋白激酶途徑活化，使hBD-2的表達水平顯著升高，hBD-2可通過直接殺滅病原菌和參與獲得性免疫應答發揮抗菌功能[2]。酸性成纖維細胞生長因子(human acidic fibroblast growth factors,haFGF)是成纖維細胞生長因子家族成員之一。haFGF具有廣泛的生物學作用，能誘導多種細胞分化、增殖、營養和保護神經元，促進傷口修復，誘導缺血區血管形成[3]。研究發現haFGF-1對創傷、糖尿病潰瘍等多種皮膚損傷都有良好的促愈合作用[4]。hBD-2和haFGF-1可在痤瘡的治療中發揮協同作用，同時發揮抑菌、調節免疫和促進傷口愈合的作用。融合技術可有效構建雙功能蛋白，通過構建hBD-2和haFGF融合蛋白，有助于為痤瘡的治療開發新型治療藥物。因此，本研究擬通過構建hBD2-haFGF1融合基因，原核表達獲得hBD2-haFGF1蛋白，通過生物信息學分析獲得融合蛋白的理化性質，為進一步的分離純化和藥理活性研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Prime STAR HS 高保真酶(日本Takara公司)；T4連接酶(美國NEB公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)；快速質粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)；EcoRⅠ 限制性內切酶(美國NEB公司)；XhoⅠ 限制性內切酶(美國NEB公司)；胰蛋白胨(廣東環凱微生物科技有限公司)；逆轉錄試劑盒(日本Takara公司)；總RNA提取試劑盒(碧云天生物技術公司)；酵母粉(廣東環凱微生物科技有限公司)。大腸埃希菌E.coliDH-5α、大腸埃希菌E.coliBL(21)和pET21b載體均為本室保存。

1.2 方法 1.2.1 引物的設計與合成

依據hBD-2基因序列(GenBank: AF071216.1)和haFGF-1基因序列(GenBank: 15055546)分別設計2對PCR引物。見表1。采用碧云天mRNA提取試劑盒采集人肝癌細胞HepG2 mRNA，檢測RNA純度和質量合格后，反轉錄成cDNA。以cDNA為模板分別擴增hBD-2基因和haFGF-1基因。RT-PCR體系：Primer STAR HS 10 μL，dNTP 4 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，模板1 μL，加入ddH20至50 μL。反應程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，程序運行30個循環。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，天根瓊脂糖回收試劑盒回收目標條帶，送上海英濰捷基測序。

表1 hBD-2和haFGF-1 RT-PCR引物Table 1 RT-PCR primers for hBD-2 and haFGF-1

1.2.2 SOE-PCR構建hBD2-haFGF1融合基因

另設計2對引物，見表2。分別擴增hBD-2-linker基因和linker-haFGF-1基因，瓊脂糖凝膠電泳分別回收基因條帶。同時以hBD-2-linker基因和linker-haFGF-1基因為模板擴增hBD2-haFGF1融合基因，反應體系：Primer STAR HS 10 μL，dNTP 4 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，hBD-2-linker0.5 μL，linker-haFGF-1 0.5 μL，加入ddH20至50 μL。反應程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，程序運行30個循環。1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收目標條帶，送上海英濰捷基測序。

表2 hBD-2-linker和linker- haFGF-1 PCR引物Table 2 PCR primers for hBD-2-linker and linker-haFGF-1

1.2.3hBD2-haFGF1/pET21b表達載體的構建

融合基因分別在F端引入了EcoRⅠ 酶切位點，在R端引入了XhoⅠ 酶切位點，并且均設計了保護堿基，因此分別對hBD2-haFGF1融合基因和pET21b質粒進行雙酶切，反應體系：質粒/基因1 μg、EcoRⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，buffer 5 μL，加入ddH20至50 μL，37 ℃反應2 h。瓊脂糖凝膠電泳，分別回收588 bp和5 400 bp左右條帶。

構建hBD2-haFGF1基因和pET21b T4連接體系，反應體系：hBD2-haFGF1∶pET21b=3∶1(摩爾比)，T4連接酶1 μL，buffer 1 μL，加入ddH20至10 μL，16 ℃反應4 h。連接產物轉化E.coliDH-5α，Amp+LB板篩選陽性轉化子。對陽性轉化子分別進行PCR和酶切鑒定，另提取hBD2-haFGF1/pET21b質粒送公司測序，隨后將鑒定正確的hBD2-haFGF1/pET21b表達載體轉化入大腸埃希菌E.coliBL(21)構建hBD2-haFGF1/pET21b/BL(21)工程菌。

1.2.4 hBD2-haFGF1重組蛋白的誘導表達和SDS-PAGE檢測

從LB培養板中隨機挑取hBD2-haFGF1/pET21b/BL(21)單菌落培養過夜活化，以1∶100(V∶V)接種于新的LB液體培養基中，培養3.5 h后，加入終濃度為0.75 mmol/L的IPTG，誘導繼續培養4 h，收取菌液，離心去除培養基，超聲破碎，12 000 r/min離心，分別取誘導前全菌和誘導后全菌、誘導后上清、誘導后沉淀進行SDS-PAGE，碧云天超快速染色試劑盒染色。

誘導后的蛋白經過SDS-PAGE后，轉膜，封閉1 h，TBST洗滌3次，小鼠抗人6×His抗體4 ℃孵育過夜(1∶2 000)，TBST洗滌3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，化學發光，成像系統掃描。

1.2.5 hBD2-haFGF1重組蛋白的生物信息學分析[5]

hBD2-haFGF1物理化學性質采用ProtParam tool工具進行分析。二級結構預測采用SOPMA Secondary Structure Prediction Method，預測蛋白的二級結構和折疊類型。氨基酸保守區域分析采用CDD工具。采用ProtScale工具分析各氨基酸的疏水性。三級結構預測采用CBS預測分析生成，采用SPDBV_4.10軟件導出三維構象圖片。

2 結果

2.1 hBD-2基因和haFGF-1基因的克隆

以人肝癌細胞HepG2 cDNA為模板，使用特異引物進行RT-PCR擴增，分別擴增獲得123 bp的hBD-2基因和420 bp的haFGF-1基因，同預期相符。見圖1。

1234567420bp123bp

1、2、3.hBD-2基因； 4. DL10000 marker； 5、6、7.haFGF-1基因。

圖1RT-PCR擴增hBD-2基因和haFGF-1基因

Figure1RT-PCR amplification ofhBD-2 andhaFGF-1 gens

2.2 hBD2-haFGF1融合基因的構建

通過新設計的引物擴增獲得了168 bp的hBD-2-linker基因和465 bp的linker-haFGF-1基因，隨后通過SOE-PCR，獲得588 bp左右hBD2-haFGF1融合基因條帶，hBD-2和haFGF-1基因之間采用45 bp的linker基因連接。見圖2。

2.3 hBD2-haFGF1/pET21b原核表達載體的構建和鑒定

構建好的hBD2-haFGF1/pET21b分別通過PCR和雙酶切進行鑒定，PCR結果顯示陽性轉化子在588 bp左右有陽性條帶。通過EcoRⅠ 和XhoⅠ 雙酶切，可見588 bp和5 300 bp左右的條帶，符合預期片段大小，見圖3。進一步的測序結構顯示基因序列比對符合率100%，無基因突變(結果未展示)。

1234200500100020004000700010000bp

1. DL10000 marker； 2.hBD-2-linker基因； 3.linker-haFGF-1基因； 4.hBD2-haFGF1融合基因。

圖2SOE-PCR構建hBD2-haFGF1融合基因

Figure2Construction ofhBD2-haFGF1 fusion gene by SOE-PCR

200500100020004000700010000bp200500100020004000700010000bp12345612345

A.hBD2-haFGF1/pET21b PCR鑒定：1. DL10000； 2.空白對照組； 3、4、5. 陽性轉化子； 6.陽性對照。B.hBD2-haFGF1/pET21b 雙酶切鑒定：1. DL10000； 2.hBD2-haFGF1/pET21b； 3和4分別為EcoRⅠ 和XhoⅠ 單酶切； 5.EcoRⅠ 和XhoⅠ 雙酶切。

圖3hBD2-haFGF1/pET21b原核表達載體的構建和鑒定

Figure3Construction and identification of prokaryotic expression vector ofhBD2-haFGF1/pET21b

2.4 hBD2-haFGF1蛋白的誘導表達和鑒定

比較誘導前后的菌體，誘導后的全菌在23 800左右有明顯蛋白條帶(圖4A)，Western blot結果同樣顯示在23 800左右有特異條帶，表明hBD2-haFGF1蛋白得到正確表達。比較超聲破碎離心后的上清和沉淀，可發現表達主要存在于沉淀中(圖4A)，hBD2-haFGF1蛋白主要以包涵體形式存在。見圖4。

2.5 hBD2-haFGF1蛋白的生物信息學分析2.5.1 一般性質

融合蛋白的氨基酸數目為220個，理論分子量為23 800，理論pI為8.81，分子式為C1040H1619N305O313S13，預測半衰期在哺乳動物中>30 h，在酵母中>20 h，在大腸埃希菌中>10 h。不穩定指數(instability index)為41.82，為不穩定蛋白。脂溶性指數(aliphatic index)61.59。兩親性指數(grand average of hydropathicity)為-0.609。氨基酸序列： MASMTGGQQMGRGSEFGIGDPVTCLKSGAICHPVFC PRRYKQIGTCGLPGTKCCKKPGGGGSGGGGSGGGGS FNLPPGNYKKPKLLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRD RSDQHIQLQLSAESVGEVYIKSTETGQYLAMDTDGLLY GSQTPNEECLFLERLEENHYNTYISKKHAEKNWFVGL KKNGSCKRGPRTHYGQKAILFLPLPVSSDLEHHHHHH。

AB1234512?103705540352515?103705540352515100

A. hBD2-haFGF1蛋白的SDS-PAGE分析：1. protein marker； 2.誘導前全菌； 3.誘導后全菌； 4.誘導后超聲破碎后上清； 5.誘導后超聲破碎后沉淀。B. hBD2-haFGF1蛋白的Western blot鑒定：1. protein marker； 2.誘導后全菌。

圖4hBD2-haFGF1蛋白的誘導表達和鑒定

Figure4Inducible expression and identification of hBD2-haFGF1 protein

2.5.2 hBD2-haFGF1蛋白的二級結構分析

hBD2-haFGF1融合蛋白主要由延伸鏈(extended strand)(27.27%)、β轉角(Beta turn)(13.18%)和隨機卷曲(random coil)(53.64%)組成。見表3、圖5。

2.5.3 hBD2-haFGF1蛋白保守結構域分析

經過NCBI CDD程序分析顯示，融合蛋白N端有β防御素保守結構域，C端具有FGF超家族保守結構域，E-value值顯示均兩者具有高度同源性。見圖6。

表3 hBD2-haFGF1蛋白的二級結構分布Table 3 Secondary structure distribution of hBD2-haFGF1 protein

1001505010015050

注:藍線：helix； 紅線：bridge； 綠線：turn； 紫線：coil。

圖5hBD2-haFGF1蛋白的α螺旋、β轉角和無規則卷曲的分布

Figure5Distribution of alpha helix,beta turn and random coil of hBD2-haFGF1 protein

2550751001251501752002201

圖6hBD2-haFGF1蛋白的保守結構

Figure6Conservative domain of hBD2-haFGF1 protein

2.5.4 hBD2-haFGF1蛋白的疏水性分析

疏水性分析結果顯示hBD2-haFGF1蛋白為親水性蛋白。第108位天冬氨酸具有最高的親水性(-2.767)，205位亮氨酸具有最高的疏水性(-2.389)。見圖7。

2.5.5 hBD2-haFGF1蛋白的三級結構預測

利用CBS結果預測hBD2-haFGF1蛋白的三級結構，SPDBV_4.10可視化后顯示hBD2-haFGF1蛋白的三級結構如圖8所示。

3210-1-2-3SCOreRrotScaleoutputforuser_sequenceHphob./Kyte&DoolittlePosition10015020050

圖7hBD2-haFGF1蛋白的疏水性分析

Figure7Hydrophobicity analysis of hBD2-haFGF1 protein

圖8hBD2-haFGF1蛋白的三級結構構

Figure8Tertiary structure of hBD2-haFGF1 protein

3 討論

痤瘡是一種常見的毛囊、皮脂腺慢性炎癥疾病，其發病主要與痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)、皮脂腺導管的角化、皮脂大量分泌、炎癥因子產生有關[6]。痤瘡的治療以抗菌、抗角化、抗雄性激素和抑制瘢痕形成為主[7]。痤瘡是一種自限性疾病，臨床治療過程中應避免使用副作用大的藥物，同時嚴重痤瘡如果得不到妥善治療，痤瘡導致的色素沉著和較大的瘢痕往往難以修復，極大地影響患者的美觀和心理健康，為此開發新型抗痤瘡藥物有其現實意義。

hBD-2具有抗菌活性和免疫調節功能，可通過直接與細菌細胞膜結合，破壞細胞膜完整性，從而導致菌體死亡，還可趨化樹突狀細胞和記憶T細胞，提高機體獲得性免疫水平[8]。在痤瘡病損部位，P.acnes為hBD-2的主要誘導源，P.acnes可刺激皮脂腺細胞產生抗菌肽和hBD-2[9]。haFGF和堿性成纖維因子(bFGF)均可用于痤瘡的治療，如與點陣鉺激光、微晶磨面等技術相結合，促進痤瘡患者瘢痕創面的愈合，下調Ⅰ型前膠原基因的表達，減少I型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、VEGF的含量[10]。相對于hbFGF，haFGF結合能力更強，更適合創面酸性環境，更為溫和持久的生物學活性，在痤瘡中可取得更佳的治療效果[11]。

基因融合技術可將不同的基因連接從而表達出具有多重功能的融合蛋白[12]。本研究中首先采用RT-PCR技術獲得hBD-2基因和haFGF-1基因，隨后采用SOE-PCR技術構建了hBD2-haFGF1融合基因，融合蛋白之間過近的連接可影響蛋白質的空間結構，從而影響蛋白質的功能活性，一般以5～25個氨基酸為宜[13]。本研究中采用了15個氨基酸的(Gly4Ser)3柔性連接，Gly有助于增強linker的柔性，而Ser有助于增強linker的親水性。經過IPTG的誘導，hBD2-haFGF1融合蛋白得到有效表達。hBD2-haFGF1融合蛋白以包涵體表達的形式存在，hBD-2作為抗菌肽，可對工程菌產生毒性，而包涵體表達則可避免對工程菌的殺傷作用，有助于蛋白的大量表達。

hBD2-haFGF1蛋白作為自然界不正常存在的蛋白，缺少對其相關信息的認知，這也阻礙了對其進一步的研究。生物信息學是20世紀80年代興起的一門交叉學科，是以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學[14]。本研究分別采用ProtParam tool、SOPMA Secondary Structure Prediction Method、CDD、ProtScale和CBS等生物信息學工具對hBD2-haFGF1的相關理化性質進行了預測。hBD2-haFGF1的理論分子量為23 800，理論pI為8.81。在E.coli中半衰期>10 h，表明hBD2-haFGF1適合在原核系統中表達。不穩定指數(instability index)為41.82，為一個不穩定的蛋白，提示在后續的分離純化中應注意避免蛋白的降解。脂溶性指數61.59表明蛋白具有較好的熱穩定性。hBD2-haFGF1蛋白保留了β防御素保守結構域和FGF超家族保守結構域。疏水性分析結果顯示hBD2-haFGF1蛋白為親水性蛋白，便于進一步的分離純化。

綜上所述，本研究構建了hBD2-haFGF1融合基因的原核表達載體，并成功在體外誘導表達了hBD2-haFGF1蛋白，并對融合蛋白的理化性質進行了生物信息學分析。本研究為進一步的蛋白分離純化和藥理活性研究提供了基礎。