JAK2/STAT3信號對二氫楊梅素誘導骨肉瘤 MG-63細胞凋亡及其遷移的影響

吳倩，江波

(襄陽市中心醫院，湖北文理學院附屬醫院，湖北 襄陽 441021)

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的骨惡性腫瘤，在兒童和青少年中具有較高的發病率，一旦發病進展較快，死亡率較高。骨肉瘤的發病率約為(6～8)/100萬，且近年來發病率有所上升[1-2]。臨床治療骨肉瘤的方式常見的主要是手術以及放化療等，但由于其侵襲性強，部分患者經過治療后病情可得到有效緩解，但仍有不少患者隨后因腫瘤的轉移和復發而致治療無效[3]。目前已有的輔助化療藥物雖可抑制骨肉瘤病灶轉移，但臨床效果不盡人意，并常伴發各種毒副作用[4]。

二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)廣泛存在于植物性食物中，以藥用植物龍涎香中含量較多，屬于黃酮類化合物，研究證實其具有很好的控制血糖、抗凋亡、抗癌、抗動脈粥樣硬化等藥理活性[5]。而DMY這些活性的機制分別與促進肝糖原和胰島素的合成[6]、上調Bcl-2和下調Bax[7]、上調Caveolin-1的表達[8]、以及抑制巨噬細胞凋亡[9]等有關。此外還發現DMY可增加CL-PARP、Bax和CL-casp3等凋亡標志物的含量，抑制Bcl-2的表達而參與STAT3/Bcl-2信號通路的調控，從而促進HNSCC凋亡[10]；以及參與影響E-cadherin、MMP-9和VEGF蛋白含量的變化而降低癌細胞黏附和轉移的能力[11]。這些實驗結果為本研究打下基礎。本文研究DMY體外對骨肉瘤MG-63細胞生長、凋亡、侵襲和遷移，以及凋亡信號通路的影響，以期為臨床選用DMY治療骨肉瘤奠定基礎。

1 材料

1.1 藥物與細胞

DMY購于國家標準物質網，批號MUST-13013108，HPLC測得其質量分數>99%。骨肉瘤MG-63細胞購于中國科學院上海細胞研究所，培養于本院細胞實驗室。

1.2 試劑與儀器

順鉑(齊魯制藥有限公司，批號：8090162DB)；胎牛血清(德國PAA公司，批號：A15108-1479)；DMEM培養液(美國GIBCO公司，批號：8117050)；溴化二甲噻唑二苯四氮(MTT,美國Sigma公司，批號：M2128)；蛋白裂解液(Roche公司)；PVDF膜(Amersham Pharmacia公司)；Transwell小室(美國康寧公司)；鼠抗人p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1(1∶500)、Bcl-xL、Bax、Bak及GAPDH 抗體(Abcam公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國Yeasen公司)；SW-CJ-2F超凈工作臺(中國吳江市偉峰凈化設備有限公司)；2406-2型CO2培養箱(美國SHEL-LAB公司)；MK3型酶聯免疫檢測儀(Thermo Labsystems公司)。

2 方法

2.1 細胞培養

將液氮中保存的骨肉瘤MG-63細胞取出，以最快速度放入預熱至37 ℃的水浴鍋中，待凍存的MG-63細胞完全融化后，加入DMEM培養液(含10%胎牛血清)，接種于培養瓶，置于5%(φ)CO2、37 ℃培養箱中進行孵育，0.25%胰酶進行消化和傳代，待細胞培養至對數生長期時取出進行以下實驗。

2.2 MTT法檢測細胞活性

將方法“2.1”中培養至對數生長期的MG-63細胞，用DMEM培養液調整密度，按每孔200 μL培養液、5×103個細胞接種于96孔培養板中，置于培養箱中繼續培養24 h，將培養液吸出，隨機分組，藥物組分別加入10、20、40、60、80、100 μmol/L的DMY溶液進行培養，每個濃度設6個復孔，另外設空白對照組。將各板放入培養箱，繼續培養至24 h、48 h和72 h后分別取出一塊板，將各孔均加入2 mg/mL的MTT溶液20 μL，再次培養4 h后，將上清液移棄，加入DMSO溶液150 μL，遮光條件下充分振蕩使溶解均勻，最后將酶標儀調整至492 nm，檢測96孔板各孔吸光度(A)值，根據吸光度值計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率(%)=(A對照-A實驗/(A對照-A空白)。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡

同“2.2”取對數生長期的MG-63細胞用DMEM培養液稀釋為1×106/mL的細胞懸液，接種于培養瓶中，培養24 h后隨機分組，藥物組加入DMY(終濃度分別為10、20、40 μmol/L)，空白對照組加入等體積的DMEM培養液，將培養瓶繼續培養48 h，用0.25%胰酶消化細胞，加入Binding緩沖液300 μL懸浮細胞，加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，并于20 ℃條件下避光孵育15 min；再加入5 μL PI染色液混勻，用流式細胞儀對細胞凋亡率進行檢測。

2.4 Transwell小室法檢測細胞侵襲能力

在Transwell培養皿上室面的底部鋪好Matrigel(預先用DMEM培養液稀釋，體積比1∶8)50 μL，37 ℃下放置6 h。將對數生長期、不含血清的DMEM處理24 h的MG-63細胞接種于Transwell小室的上室中，加入DMY(濃度分別為10、20 μmol/L)，空白對照孔加入相等容積的DMEM培養液，培養24 h后，取出濾膜，將表面上未侵襲的細胞用棉簽除去，小室置于濃度為4%(φ)多聚甲醛中固定15 min，0.5%結晶紫溶液室溫染色20 min，再用PBS緩沖液漂洗3次，風干后于光學顯微鏡下(放大倍數為100倍)隨機選取5個視野，對膜背面的細胞數(N)進行計數，并計算平均數值，該數值大小即反映細胞的侵襲能力。侵襲抑制率=(1-N實驗組/N對照組)×100%。

2.5 Transwell小室法檢測細胞遷移能力

MG-63細胞的遷移實驗方法是在Transwell培養皿上室的底部鋪好基質膠，剩余流程同“2.4”細胞侵襲實驗。計算遷移抑制率=(1-N實驗組/N對照組)×100%。

2.6 Western blot法檢測Cyclin D1、 p-JAK2、 p-STAT3、Bcl-xL、Bax和Bak的表達

將骨肉瘤MG-63細胞隨機分組，各組分別加入不同濃度的DMY(0，10、20、40 μmol/L)，培養48 h，用預冷的PBS沖洗MG-63細胞3次后加入蛋白裂解液進行裂解細胞，抽取蛋白，置于冰上30 min。并于4 ℃環境下12 000 r/min離心10 min，取上清液，每管取15 μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸5 min，行PVDF膜(100 V 90 min)凝膠電泳，5%脫脂牛奶進行封閉1～2 h。加入一抗溶液(鼠抗人p-JAK2、p-STAT3、Bcl-xL、Cyclin D1(1∶500)、Bax、Bak及GAPDH抗體)，4 ℃環境下過夜，然后用TBST洗10 min，重復3次，加入兔抗羊、羊抗兔及羊抗鼠二抗，室溫下旋轉孵育1 h，TBST洗滌。進行化學發光，X光片壓片、顯影和定影，并對數據進行分析。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 DMY對MG-63細胞活性的影響

MTT法檢測結果表明，各濃度的DMY體外均能明顯抑制人骨肉瘤MG-63細胞的增殖，與空白對照組相比，差異均具有統計學意義(P<0.01)，并隨著DMY濃度的增加和培養時間的延長，其抑制MG-63細胞增殖的能力逐漸增強。具體結果見表1。

3.2 DMY對MG-63細胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測發現，各濃度的DMY作用于MG-63細胞，各組凋亡率均較空白對照組明顯升高(P<0.05或P<0.01)。隨著DMY濃度的增大，細胞凋亡率也逐漸增大，具有濃度依賴性，見表2。

3.3 DMY對MG-63細胞體外侵襲能力的影響

結果顯示，10、20 μmol/L DMY作用MG-63細胞侵襲數均明顯較空白對照組低(P<0.01)，提示DMY體外可抑制MG-63細胞的侵襲，該抑制能力具有濃度依賴性，與低濃度組(10 μmol/L)相比，高濃度(20 μmol/L)的DMY侵襲細胞數顯著減少(P<0.05)，見表3。

3.4 DMY對MG-63細胞體外遷移能力的影響

10、20 μmol/L的DMY遷移細胞數均顯著低于空白對照組(P<0.01)，并隨濃度的增大，遷移細胞數減少，提示DMY能濃度依賴性抑制MG-63細胞的體外遷移，與低濃度組(10 μmol/L)相比，高濃度(20 μmol/L)的DMY遷移細胞數顯著減少(P<0.01)，見表4。

表1 DMY對MG-63細胞活性的影響Table 1 Effect of dihydrocarbamide on the activity of MG-63 cells

與空白對照組比較：**P<0.01。

表2 DMY對MG-63細胞凋亡的影響

組別c/(μmol·L-1)凋亡率/%空白對照組-4.89±0.53DMY組108.11±1.75?2020.52±1.59??4027.63±2.21??

與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

表3 DMY對MG-63細胞侵襲能力的影響

組別c/(μmol·L-1)細胞數(個/視野)抑制率/%空白對照組-192.34±9.47-DMY組10119.69±11.14??37.7720101.94±9.59??△47.01

與空白對照組比較：**P<0.01；與DMY(10 μmol/L)組比較：△P<0.05。

表4 DMY對MG-63細胞遷移能力的影響

組別c/(μmol·L-1)細胞數(個/視野)抑制率/%空白對照組-420.18±17.11-DMY組10 289.45±23.95??31.1120235.90±19.83??△△43.86

與空白對照組比較：**P<0.01；與DMY(10 μmol·L-1)組比較：△△P<0.01。

3.5 DMY對MG-63細胞相關蛋白表達的影響

Western blot法檢測結果顯示，DMY各組Cyclin D1、p-JAK2、p-STAT3、Bcl-xL表達均減少，并且各蛋白水平隨藥物濃度的增加而降低；而Bax和Bak表達上調，并隨濃度的增加而升高。見圖1和表5。

CyclinD1p-JAK2p-STAT3BaxBakBcl-xlGAPPH1234

1.空白對照；2.10 μmol/L DMY；3.20 μmol/L DMY；4.40 μmol/L DMY。

圖1DMY對MG-63細胞JAK2/STAT3通路相關蛋白的影響

Figure1Effect of dihydrocarbamide on the expression of proteins related to the JAK2/STAT3 pathway in MG-63 cells

4 討論

龍涎香是中國南方廣泛種植的藥用植物，其作為中草藥常用于醫療目的，包括抗腫瘤。DMY是龍涎香中發揮藥理作用的主要有效成分，作為一種藥食同源的天然化合物，藥理作用廣泛。然而其是否存在抗骨肉瘤的作用及機制尚無研究。本研究采用MTT法檢測發現，隨著DMY劑量的逐漸增加和培養時間的延長，其對骨肉瘤MG-63細胞體外生長的抑制能力也逐漸增強；還可濃度依賴性地誘導MG-63細胞凋亡、抑制MG-63細胞的侵襲和遷移能力。以上結果可初步證明DMY具有誘導MG-63細胞凋亡及抑制其轉移的活性。細胞是在機體精密的調控下進行正常的增殖和凋亡，而腫瘤細胞由于凋亡受到抑制，增殖和凋亡水平失衡，才導致無限增殖[12]。腫瘤細胞向周圍其他組織進行侵襲和遷移是引起腫瘤轉移的重要原因， 也是導致腫瘤患者治療無效和死亡的重要因素之一。通過各種機制降低細胞向遠處侵襲和遷移的能力，是治療惡性腫瘤的有效措施，也是相關凋亡因子發揮作用的結果。

表5 DMY對MG-63細胞JAK2/STAT3通路相關蛋白的影響Table 5 Effect of dihydrocarbamide on the expression of proteins related to the JAK2/STAT3 pathway in MG-63 cells

與空白對照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

腫瘤細胞受到各種死亡因子的刺激時，在機體調控下會激活或失活一系列的信號通路來調節其生存。JAK2/STAT3信號通路廣泛存在于生物體內，是一種由多種細胞因子共同作用的信號轉導通路，參與并調控細胞的生長、凋亡、免疫調節以及侵襲和遷移等多種生理變化，在腫瘤發展過程中起著舉足輕重的作用[13-14]。已發現在多種腫瘤組織包括口腔癌、胃癌、膀胱癌等的侵襲轉移中，均發現有JAK2/STAT3信號通路的異常活化[15-17]。JAK/STAT信號通路的組成包括酪氨酸激酶JAK家族和轉錄因子STAT家族[18]，在該通路中，許多細胞外信號與靶細胞膜上的細胞因子受體結合并將胞質內JAK激活，活化的JAK通過與細胞膜上的細胞因子受體偶聯而使其酪氨酸殘基磷酸化，而磷酸化位點又與STAT 蛋白上SH2相結合，并在JAK的催化下磷酸化STAT。磷酸化的STAT與其受體親和力降低，離開受體，2個STAT分子形成二聚體轉移到細胞核與DNA結合，促進相應基因的表達，從而產生抗凋亡、促細胞生存等作用。姬穎華等[19]研究顯示，白藜蘆醇通過抑制IL-6的表達來調節JAK2/STAT3信號通路，促進伯基特淋巴瘤細胞凋亡。

本研究探討了JAK2/STAT3信號通路在DMY抑制骨肉瘤MG-63細胞生長中所發揮的影響，結果表明DMY可明顯抑制Cyclin D1的表達、JAK2酪氨酸1007和STAT3的磷酸化，抑制抗凋亡基因Bcl-xL而促進Bax及Bak的表達。由此可推斷DMY通過調控JAK2/STAT3信號通路中有關蛋白水平的表達，從而降低骨肉瘤細胞的侵襲和遷移的能力，并誘導其凋亡。

綜上所述，DMY可通過影響MG-63細胞JAK2/STAT3信號通路而抑制其生長，并誘導其凋亡，還降低其向其他組織中進行侵襲和遷移的能力，為其抗骨肉瘤的作用機制奠定了一定的基礎。同時提示JAK2/STAT3通路可能是骨肉瘤治療的新靶點，為骨肉瘤的臨床治療提供了新的出發點。