裂褶多糖制備及化學改性研究進展

黃嘉欣，李岳峰，馬偉銳，朱爽，周林,2

(1.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006; 2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640)

裂褶菌(Schizophyllumcommune)又稱白參、樹花等，隸屬于裂褶菌科(Schizophyllaceae)，裂褶菌屬(Schizophyllum)。裂褶菌子實體味道鮮美，是一種營養(yǎng)豐富的食材，具有滋補、鎮(zhèn)靜等作用。裂褶多糖(Schizophyllan，SPG)是裂褶菌的主要活性物質之一，可以通過裂褶菌子實體提取或菌絲體液體發(fā)酵獲得。SPG屬于一種非離子型的水溶性高聚葡萄糖，主鏈由1,3-β-D-吡喃葡萄糖單元組成，每3個葡萄糖分子產生一個β-1，6-結合的D-吡喃葡萄糖分支，大多數(shù)分子質量在 (6～12)×106g/mol之間[1]。SPG具有多種生理活性，如抗腫瘤、增強免疫、保濕、抗氧化等，在癌癥治療以及提高細胞免疫功能中均有一定作用[2]。

通過Pubmed、Web of Science等數(shù)據(jù)庫對SPG相關的文獻進行檢索，可以得到相似的結果。以Pubmed檢索為例，截止至2018年6月份，采用題名或摘要檢索方式針對含義相似的不同的檢索詞，如Sizofiran(施佐非蘭)，Sonifilan，Schizophyllan，分別檢出 48、16和318篇論文。其中Sizofiran和Sonifilan主要是日本學者使用，Schizophyllan則更為通用。近20年SPG的研究獲得持續(xù)關注，年平均發(fā)文數(shù)量達15～20篇，2004—2005年發(fā)表量最多，超過了30篇。從累計發(fā)文數(shù)量來看，日本科學家的關注度最高，發(fā)文前10的機構中有8家是日本的，主要是高等院校。包括九州大學、北九州市立大學、日本大阪大學等。國內武漢大學和日本的立命館大學發(fā)文均達到11篇，處于并列第6。從論文涉及的領域來看，排在前5的是化學、生物化學分子生物學、聚合物科學、藥理學藥劑學、生物技術應用微生物學。2015年，在聚合物科學領域的研究日益增多，反映了裂褶多糖在生物材料、醫(yī)藥載體等領域的深度開發(fā)是當前的熱點。目前國內尚未對裂褶多糖進行深入開發(fā)，本文對SPG的發(fā)酵法制備、提取工藝、化學改性等研究進展進行綜述，并提出了后續(xù)研究的建議。

1 裂褶多糖的制備

SPG的制備方法主要分為兩類，一類是從裂褶菌子實體中提取，另一類則是從裂褶菌深層發(fā)酵液中分離。由于子實體培植周期長、受環(huán)境因素影響大等原因，采用從裂褶菌深層發(fā)酵液中提取的方法更適應工業(yè)化生產[2]。而發(fā)酵條件對多糖的得率起著決定性的影響，表1歸納了涉及SPG發(fā)酵的代表性文獻。

從表1可知，目前SPG發(fā)酵的時間大多是5～7 d，發(fā)酵所得菌體量11.10～12.80 g/L，多糖量4.20～15.50 g/L。發(fā)酵時間為5 d時，Kim報道的多糖產量15.50 g/L，略高于Udo報道的12.00 g/L[1,11]。而國內的報道大都低于6 g/L。因而SPG發(fā)酵條件還可以進一步優(yōu)化。除了碳氮源等基本的培養(yǎng)基成分，生長因子、表面活性劑等微量組分的影響也值得關注，鄭文科等在搖瓶水平上加入VB1、 谷氨酸、 檸檬酸和油酸4種生長因子，經過正交實驗的優(yōu)化后，產出的多糖量可達5.73 g/L，比空白對照的樣品提高了0.64 g/L[10]。張雖栓等通過正交實驗發(fā)現(xiàn)加入0.2% Tween80可以提高SPG的產量[12]。

表1 裂褶多糖的發(fā)酵條件Table 1 Fermentation conditions of SPG

值得注意的是，文獻[6]采用了硫酸苯酚法測定SPG含量，其他文獻均采用了醇沉法測定。另外，文獻[8]中生物量測定時，沒有充分洗滌菌體，70.40 g/L的生物量遠高于其他文獻的報道。

2 裂褶多糖分離與提純工藝

SPG提取的目的就是將多糖從其子實體、菌絲體或者發(fā)酵液中分離出來，而且還要保持多糖原有分子結構以避免其活性發(fā)生改變[2]。相比起酶法提取、熱水提取、稀堿提取等傳統(tǒng)提取方法，超聲提取、微波提取、閃式提取等輔助手段能提高SPG提取效率。其中超聲提取和微波提取法對于提取子實體中的多糖，效果最為顯著。發(fā)酵液中的SPG多糖可以采取微濾、超濾等工藝過程，規(guī)模化制備的相關文獻報道較少。見表2。

3 裂褶多糖改性及應用

SPG在抗腫瘤、免疫調節(jié)等方面的活性，賀鳳等已經進行了詳細的綜述[2]。在SPG改性的研究中，主要的改性方法有羧化、羧甲基化、磷酸酯化、硫酸酯化以及將SPG用于復合物的制備等。以下主要介紹SPG在化學改性、藥物載體、化妝品等應用方面的進展。

3.1 羧化與羧甲基化

周林等[18]采用氫氧化鈉-氯乙酸反應體系合成了不同取代度的羧甲基裂褶多糖。鄭必勝等[19]發(fā)現(xiàn)羧甲基裂褶多糖的保濕效果優(yōu)于改性前的裂褶多糖；因裂褶多糖活性與其三螺旋構象相關，Yoshiba等[20]通過高碘酸鈉-次氯酸鈉反應體系合成了羧基化的裂褶多糖，并對具有不同羧化程度的多糖分子量及構象進行了研究，此外Yoshiba等[21]還將側鏈羧基化裂褶多糖通過碘酸鹽氧化后與綠泥石氧化合成為三聚體，探究其在含有0.1 mol/L NaCl的氧化氘溶液中有序-無序轉變。

3.2 磷酸酯化

馮小玲等[22]以三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉制備磷酸化裂褶多糖，用單因素試驗探究了反應條件對磷酸化反應取代度的影響，發(fā)現(xiàn)磷酸基團的引入使SPG水溶性以及對皮膚的保濕性能和抗氧化性能略有提高，磷酸化裂褶多糖可作為潛在的保濕劑。

3.3 硫酸酯化

司麗娜[23]用濃硫酸法對裂褶菌胞外多糖進行硫酸化修飾，采用鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)500 μg/mL的硫酸化裂褶多糖較改性前抗氧化活性提高28.88%；張雖栓等[24]用磺酰化法對裂褶多糖進行硫酸酯化，鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定羥自由基清除率，發(fā)現(xiàn)硫酸酯化可提高SPG的抗氧化活性。

3.4 裂褶多糖復合物

近年來SPG作為藥物載體的研究日益增多。在藥物傳遞方面，Maeda等[25]將萘分子接入SPG(nSPG)的側鏈形成了納米凝膠并獲得了攜帶疏水性化合物阿霉素的能力，通過體外測定揭示了這種納米凝膠可以作為載體將抗癌藥物特異性遞送至免疫細胞；Mochizuki等[26]將siRNA與SPG制成復合物用于小鼠急性肝炎模型，發(fā)現(xiàn)該復合物遞送系統(tǒng)能克服RNA干擾治療問題； Mochizuki[27]還利用石英晶體微天平(QCM)對不同類型的DECTN-1與 SPG進行了結合機制的分析；Kobiyama等[28]的研究表明K3-SPG可用于需要Ⅰ型和Ⅱ型IFN以及CTL誘導的免疫治療；Zhang等[29]開發(fā)了一種新的小干擾RNA(siRNA)傳遞系統(tǒng)，將siRNA結合到SPG中，通過SPG受體Dectin-1參與特異性地沉默CD40基因(siCD40)以發(fā)揮免疫調節(jié)活性。Ye-RamKim等[30]開發(fā)了SPG與c-Src SH3肽復合物，可經靶向遞送至巨噬細胞，其對小鼠ROS介導的炎性疾病模型(例如某類敗血癥和某種結腸炎)具有顯著的治療效果。Kitahata等[31]證明SPG 與CpG DNA的復合物K3-SPG單獨給藥治療具有抗腫瘤作用，靜脈注射該復合物可靶向腫瘤微環(huán)境；Izumi等[32]利用DA40-SPG復合物沉默Y-盒結合蛋白1(YB-1)基因，該結果可被用于抑制非小細胞肺癌的生長。

在疫苗研制方面，Kobiyama等[33]指出K3-SPG復合物可以克服CpG-ODN的物種屏障以增強抗原特異性CD8+T細胞應答；Yokokawa等[34]將HCVcc與裂褶多糖(K3-SPG)等聯(lián)合制成疫苗，成功誘導狨猴對HCV丙肝病毒的體液及細胞二重免疫， 該疫苗有望成為預防丙型肝炎病毒的新選擇。Ito等[35]針對持續(xù)性乙型肝炎病毒(HBV)感染的特點，用HBsAg和K3-SPG進行的疫苗接種，發(fā)現(xiàn)使用K3-SPG的疫苗可以克服HBV耐受性，為慢性HBV感染的患者帶來福音。Mochizuki等[36]制備了肽-dA/SPG復合物(抗原肽OVA257—264、DA40及SPG)，該三元復合物能以低劑量誘導高水平CTL細胞應答及抗原呈遞，表明其可能適用于合成疫苗抗原。Noriko 等[37]利用裂褶多糖(SPG)與同源寡聚脫氧核苷酸(ODN)形成多糖核酸復合物，該復合物可用于抗原呈遞細胞(APC)的特異性遞送，并為利用SPG設計免疫細胞靶向藥物遞送系統(tǒng)提供了新思路。Masuta等[38]用人源化的CpG DNA(K3)與裂褶多糖(SPG)構建復合物并在非人靈長類動物模型中測試其對免疫治療的作用，發(fā)現(xiàn)K3-SPG具有強大的AG特異性記憶CTL反應增強能力，有望發(fā)展為一種慢性感染性疾病和癌癥的免疫治療劑。Fujiwara等[39]發(fā)現(xiàn)了AS014/SPG復合物抑制細胞生長的機制，并證實了細胞內復合物具有不同分布性。

表2 裂褶多糖的提取方法Table 2 Extraction methods of SPG

可見，SPG復合物主要利用的是裂褶多糖的抗腫瘤及增強免疫的活性，目標應用領域主要是免疫治療，包括免疫遞送系統(tǒng)、疫苗制備等。

3.5 在化妝品中的應用

SPG具有保濕、延緩衰老、促進上皮纖維成細胞增殖和美化膚色等多種功能[40]，被化妝品原料市場所認可。SPG與多種草本植物提取物聯(lián)合使用,可以增強抗氧化、抗皺紋和美白效果[41]。國內外已有相關產品上市，但主要是采用分子量未分級的SPG，且原料來源于國外。不同分子量和不同取代度的SPG在保濕、抗氧化、美白等領域的活性差異使其工業(yè)化制備技術成為潛在的熱點，廣州某公司已完成了制備工藝和產品中試，并申請了相關專利。

3.6 其他應用

SPG在抗病毒、抗菌等生物醫(yī)學材料領域也有多種應用。周瑩等[42]采用熱水浸提及醇沉法提取SPG用于煙草花葉病毒的防治，對煙草花葉病毒的抑制率可達70%以上，為煙草花葉病毒的防治提供了新途徑。Abdel-Mohsen等[43]將SPG用作銀納米顆粒(Ag NPs)的還原劑和封端劑，該SPG/Ag-NPs納米復合結構在生物復合物基質中具有良好分散性。趙岳等[44]發(fā)現(xiàn)SPG對大腸桿菌、假單胞菌有一定的抑制作用。Abdelmohsen等[45]發(fā)現(xiàn)由SPG制成的幾丁質/殼聚糖-葡聚糖復合物(ChCSGC)作為傷口敷料材料具有優(yōu)異抗菌性及促傷口愈合能力。Lee等[46]利用2種類型的SPG水凝膠(SPG和PEG/SPG混合物)通過巰基烯光聚合反應形成混合物，該水凝膠因具有高度可調節(jié)性而應用范圍更廣。Sutivisedsak等[47]利用蒸餾酒糟與可溶物(DDGS)生產的裂褶多糖合成生物潤滑劑成分； Josewski等[48]利用免疫鼠的淋巴細胞構建了抗體噬菌體展示文庫，從中篩選出針對β-D-葡聚糖裂褶多糖的重組單克隆抗體(rAbs)。

4 展望

當前國內對SPG研究和應用取得了進展，但也存在定量方法和評價標準不一致、應用研究與產業(yè)化滯后等問題。為此建議：1、由于裂褶菌是一種食藥兼用的真菌，從“藥食同源”的角度考慮，應加強裂褶菌種管理，利用規(guī)模的發(fā)酵工藝，獲得穩(wěn)定均一的SPG原料，并形成不同分子量，不同取代度的系列產品；2、將裂褶多糖的測定方法形成標準，便于比較和評價不同的發(fā)酵、工藝提取過程；3、重視SPG作為藥物載體及生物醫(yī)學材料領域的研究；4、可以優(yōu)先在化妝品行業(yè)擴展SPG的商業(yè)化應用，從而促進其他領域的開發(fā)。