香菇0912液體菌種培養基及搖瓶發酵條件的篩選

李春霞 吳建金 黃亮 孫寧 王玉 班立桐

摘? ? 要：不同菌種對液體培養基中營養物質的利用效率不同，試驗以香菇0912作為供試菌株，以菌絲體干質量為指標，通過單因素試驗，研究了不同碳氮源、無機鹽含量、轉速、培養基初始pH、靜置時間以及培養基裝液量對香菇菌絲干質量的影響，結果表明最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為玉米漿，K2HPO4的最佳用量為0.1%，KH2PO4 的最佳用量為0.1%，初始pH值 5.0，裝液量為50 mL，培養溫度為25 ℃，靜置時間為24 h，轉速為180 r·min-1。在此基礎上，對液體培養基的組分含量進行了L9（34）正交試驗，結果表明4個因素對香菇菌絲干質量的影響表現為：葡萄糖>玉米漿>KH2PO4>K2HPO4，其中葡萄糖和玉米漿的含量對菌絲干質量具有極顯著影響（P<0.01），并確定了香菇0912菌株液體深層發酵各組分的優水平為葡萄糖3%，玉米漿0.3%，K2HPO4 0.05%，KH2PO4 0.05%，搭配MgSO4 0.05 %，維生素B1 0.005%，在此條件下，菌絲干質量達到2.103 g·L-1，是優化前（1.417 g·L-1）的1.49倍。

關鍵詞：香菇;液體菌種;培養基篩選;搖瓶發酵

中圖分類號：S646.1+2? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.02.001

Abstract： The utilization efficiency of nutrients in liquid medium was different among different strains. In the study， Lentinus edodes 0912 was used as the tested strain. The optimal carbon and nitrogen sources， inorganic salt content， rotational speed and initial pH of culture medium， and also the standing time and medium volume were screened through the single factor experiment， and the dry weight of mycelia was as the evaluation index. The results showed that the best carbon source was glucose， the best nitrogen source was corn pulp， the best amount of K2HPO4 and KH2PO4 was both 0.1%， the initial pH was 5.0， the liquid medium volume was 50 mL， the culture temperature was 25 ℃， the rest time was 24 h and the speed was 180 r·min-1. On the basis， the composition of liquid medium was tested by L9（34） orthogonal test. The results showed that the effects of four factors on the dry weight of L. edodes were glucose > corn pulp > KH2PO4 >K2HPO4， in which the content of glucose and corn pulp had a significant effect on the dry weight of mycelium（P<0.01）， and the optimum conditions for liquid deep fermentation of L. edodes strain 0912 were glucose 3%， corn pulp 0.3%， K2HPO4 0.05%， KH2PO4 0.05%， matched with MgSO4 0.05% and VB1 0.005%， the dry weight of mycelium could reach 2.103 g·L-1， which was 1.49 times of that before optimization （1.417 g·L-1）.

Key words：? L. edodes; liquid strain; culture medium screening; fermentation by shaking flask

香菇（Lentinus edodes）俗稱花菇、冬菇，是擔子菌綱傘形科真菌，在闊葉性原木上生長較為廣泛，被稱為“山珍之王”[1-6]。香菇中蛋白質種類繁多，必需氨基酸占有2/3的比例，能夠增強體質，促進機體發育[7]。香菇多糖（β-D-葡聚糖），具有免疫調控、健胃、助消化、抑制微生物感染、抗病毒感染、抗腫瘤和抵抗癌癥等生物活性[8]。

2016年我國的食用菌產量達3 596.7萬t，成為繼菜、糧、果、油之后的第五大農作物，而香菇產量為898.3萬t，為我國食用菌中產量第一的品種。香菇生產主要為袋栽模式，產地包括古田、慶元、磐安等老產區及西峽、平泉、岫巖等新產區。

香菇0912是撫順市農科院雜交技術選育而成的優質香菇新品種，具有出菇早、菌絲潔白濃密、抗雜性好、菌棒堅實，高溫季節出菇質量好，是遼寧地區香菇的主栽品種[9-10]，經過天津市蔬菜產業技術體系創新團隊及相關農技人員的推廣，目前在天津市薊州區栽培面積不斷擴大，但主要以農戶栽培為主，采用的均為固體菌種。香菇固體菌種有成本高、易受雜菌污染、出菇周期長、工作強度大等缺點[11]。使用液體深層發酵技術制備香菇菌種，并使用該菌種栽培香菇，是香菇高效生產的一種新途徑。液體培養具有周期短、流動快、菌絲及其代謝產物較多等優點，而且從其發酵液中提取的有效成分具有保健和藥用功能[12]。液體培養基配方的優良對香菇菌絲及其代謝產物的形成至關重要，合適的碳氮源及其比例、無機鹽的用量、培養條件對液體培養過程中菌絲的生長有很大影響，在液體發酵過程，營養菌絲在適當的條件下生長更快，新陳代謝更加旺盛。王穎等[13]以抽濾后的菌絲生物量作為指標，對液體培養基進行優化，優化后測得菌絲生物量（干質量）為56.292 g·L-1。

在相同環境下，不同菌種對液體培養基中營養物質的利用效率不同，金衛群等[14]以杏鮑菇的3種不同菌株為研究對象，結果表明不同菌株的出菇量以及生物學轉化率具有明顯差異。本研究對香菇0912菌株的液體培養基及培養條件進行優化，為該菌株液體菌種在栽培過程中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

香菇0912菌株;天津農學院農學與資源環境學院生物技術系食用菌研發中心斜面保藏菌種。

1.2 培養基

母種培養基： PDA培養基;

發酵培養基： 葡萄糖2%、玉米漿0.2%、K2HPO4 0.1%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.05%、維生素B1 0.005 %。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌絲生長曲線的測定 在搖瓶培養過程中的第4～11天取樣，過濾、烘干，計算菌絲干質量。以培養時間為橫坐標，菌絲干質量為縱坐標繪制菌絲生長曲線圖，并根據生長曲線圖確定取樣時間。

1.3.2 培養基碳源、氮源篩選 （1）在基礎培養基條件下，分別以玉米漿、麩皮、蛋白胨、酵母粉作為氮源，含量均為0.2%，5組重復，測定菌絲體的干質量， 確定最佳氮源。

（2）以玉米漿為氮源，分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、土豆粉作為碳源，含量均為2%，5組重復，在第10天取樣，測定菌絲體干質量，篩選出最佳碳源。

1.3.3 碳源、氮源、無機鹽添加量的篩選 （1）在基礎培養基條件下，設置玉米漿添加水平為0.2%，0.3%，0.4%，培養10 d，測定菌絲體干質量，確定最佳添加量。

（2）在氮源添加量為0.3%的條件下，設置葡萄糖的添加水平為2%，3%，4%，培養10 d，測定菌絲體干質量，確定最佳添加量。

（3）在氮源添加量為0.3%、碳源添加量為3%的條件下，設置K2HPO4的添加水平為0.05%，0.10%，0.15%，培養10 d，測定菌絲體干質量，確定最佳添加量。

（4）在氮源添加量為0.3%、碳源添加量為3%、K2HPO4添加量為0.10%的條件下，設置KH2PO4的添加水平為0.05%，0.10%，0.15%，培養10 d，測定菌絲體干質量，確定最佳添加量。

1.3.4 菌種培養條件篩選? ? （1）在優選的培養基基礎上，轉速梯度為120，150，180，210 r·min-1，培養10 d，測定菌絲體干質量，確定最佳轉速。

（2）在優選的培養基基礎上，轉速為180 r·min-1的條件下，設置不同裝液量梯度，裝液量依次為50，70，90，110 mL，培養10 d，測定菌絲體的干質量，確定最佳裝液量。

（3）在優選的培養基基礎上，轉速為180 r·min-1，裝液量為50 mL的條件下，設定靜置時間梯度為12，24，36，48 h，培養10 d，測定菌絲體干質量，確定最佳靜置時間。

（4）在優選的培養基基礎上，轉速為180 r·min-1，裝液量為50 mL，靜置時間為24 h的條件下，設置不同pH值梯度，依次為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，培養10 d，測定菌絲體干質量，確定最佳pH值。

1.3.5 正交試驗設計 通過單因素試驗，確定葡萄糖、玉米漿作為香菇菌絲液體培養的碳源和氮源，K2HPO4、KH2PO4為培養基中主要的無機鹽成分，并在篩選K2HPO4、KH2PO4添加量試驗的基礎上，以葡萄糖、玉米漿、K2HPO4、KH2PO4為研究因素，在初始pH值為5.0，裝液量為50 mL，靜置時間為24 h，轉速為180 r·min-1的條件下培養，設計L9（34）的正交試驗，正交試驗因素與水平設計見表1。根據菌絲生長曲線確定培養10 d時，并測定菌絲干質量。

1.4 數據處理與分析

采用DPS軟件對單因素試驗結果進行多重比較分析及正交試驗的方差分析。

2 結果與分析

2.1 香菇菌絲生長曲線

香菇菌絲生長情況，菌絲干質量在培養過程中呈現先增加后下降的趨勢，在培養的前3 d有萌發現象，在接種的菌塊表面有少量絨毛狀菌絲，第4～8天，菌絲開始緩慢生長，培養基中出現少量菌絲和較小的菌球，第8～9天，菌絲生長達到快速生長期，培養基中的菌球數量明顯增多，菌球變大，至第10天，菌絲體干質量達到最大為1.417 g·L-1，第11天菌絲干質量開始下降，因此，根據香菇0912菌絲生長曲線確定最佳取樣時間為第10天。

2.2 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

2.2.1 不同氮源 有機氮源的營養物質可作為菌絲生長中合成氨基酸、核酸、蛋白質等代謝過程中的重要物質的來源[15]。含玉米漿的液體培養基中菌絲干質量最大為1.108 g·L-1，表明香菇0912菌絲對玉米漿的利用能力最強，麩皮次之，對蛋白胨和酵母粉的利用能力最差，但各處理間差異均未達顯著水平（數據未列出），故篩選出的最佳氮源為玉米漿。

2.2.2 不同碳源 香菇0912菌絲對葡萄糖的利用能力最強，菌絲干質量為1.245 g·L-1，顯著高于使用土豆粉、蔗糖、淀粉作為碳源的菌絲干質量，根據菌絲生長情況，適合香菇0912菌絲生長的最佳碳源為葡萄糖，這與覃寶山等[16]對碳源篩選的結果一致。

2.3 營養物質不同添加量對菌絲生長的影響

2.3.1? ? 氮源添加量? ? 在玉米漿添加水平為0.2%，0.3%，0.4%的條件下，菌絲干質量呈現先增加后下降的趨勢，且在玉米漿添加量為0.3%時，菌絲干質量達到最大為1.12 g·L-1，顯著高于0.2%和0.4%處理。

2.3.2? ? 碳源添加量? ? 在葡萄糖添加水平為2%，3%，4%的條件下，菌絲干質量呈現先增加后下降的趨勢，且在葡萄糖添加量為3%時，菌絲干質量達到最大為1.009 g·L-1，顯著高于2%和4%處理。

2.3.3 K2HPO4添加量 在K2HPO4添加水平為0.05%，0.10%，0.15%的條件下，菌絲干質量呈現先增加后下降的趨勢，且在K2HPO4添加量為0.10%時，菌絲干質量達到最大為0.769 g·L-1，顯著高于0.05%和0.15%處理。

2.3.4 KH2PO4添加量? ? 在KH2PO4添加水平為0.05%，0.10%，0.15%的條件下，菌絲干質量呈現先增加后下降的趨勢，且在KH2PO4添加量為0.10%時，菌絲干質量達到最大為0.874 g·L-1，顯著高于0.05%和0.15%處理，后二者之間表現為0.15%處理顯著高于0.05%處理。

2.4 不同轉速對菌絲生長的影響

轉速越高，搖瓶中的溶氧量越多，越有利于菌絲的生長;但轉速過高會產生較大的剪切力，在培養過程中不能夠形成菌球，進而影響菌絲生長[17]。隨著搖床轉速的增加，搖瓶中溶氧量逐漸增加，但菌絲干質量呈現先增加后降低的趨勢，在轉速為180 r·min-1的條件下，菌絲干質量達到最大為1.187 g·L-1，但處理間差異均未達顯著水平（數據未列出），根據試驗結果篩選出的最佳轉速為180 r·min-1。? ? 2.5 不同裝液量對菌絲生長的影響

搖瓶裝液量越大，搖瓶中溶氧量反而降低，菌絲干質量也降低，當裝液量為50 mL時，搖瓶中溶氧量高，菌絲生長較快，代謝旺盛，菌絲干質量最大為1.221 g·L-1，顯著高于其他各處理，故最佳裝液量為50 mL。

2.6 不同靜置時間對菌絲生長的影響

隨著靜置時間的增加，菌絲干質量先增加后降低，靜置時間為24 h的搖瓶中菌絲干質量最大為1.501 g·L-1，但各處理間差異均未達顯著水平（數據未列出），根據試驗結果確定靜置時間為24 h是適合香菇0912菌株生長的最佳條件，這與覃寶山等[16]的研究結果確定的最佳靜置時間為42 h不同，其差異性可能是由于菌種和所采用的液體培養基成分的不同引起的。

2.7 不同pH值對菌絲生長的影響

pH值的高低影響細胞膜的電荷變化，酶活性以及菌絲生物量也會受該因素影響較大[18]。隨著pH值的增加，菌絲干質量基本上呈現先增加后降低的趨勢，pH值為5.0時菌絲干質量達到最大為1.534 g·L-1，顯著高于其他pH處理，pH值為8.0時搖瓶中菌絲基本沒有生長，故篩選出的最佳pH值為5.0，這與馬瓊等[19]對香菇培養條件的優化結果一致。

2.8 正交試驗結果分析

由表2可知，在不同的培養基組分下，搖瓶中香菇0912菌絲干質量以A3B3C2D1處理最大，為1.883 g·L-1;根據極差分析結果，影響菌絲干質量的各因素的主次順序為：葡萄糖>玉米漿>KH2PO4>K2HPO4，方差分析結果（表3）表明，葡萄糖和玉米漿的影響均達極顯著水平，而KH2PO4和K2HPO4均未達顯著水平;根據正交試驗篩選出適合香菇0912菌絲液體培養的培養基組合為A3B3C1D1，這與9個處理中最大值組合A3B3C2D1不一致;經驗證，在組合A3B3C1D1的條件下培養，香菇0912菌絲干質量達到2.103 g·L-1，優于A3B3C2D1，即適合香菇0912菌株生長的最佳培養基配方為葡萄糖3%，玉米漿0.3%，K2HPO4 0.05%，KH2PO4 0.05%。

3 結論與討論

碳源和氮源是菌絲生長過程中最主要的營養物質，菌絲不同的營養物質條件下的生長速率以及在生長過程中產生的代謝產物含量不同，聶建軍等[20]研究表明，當培養基中碳源為葡萄糖時，菌絲生物量和胞外多糖產量均明顯高于蔗糖，分別提高了5.83和0.85倍。因此，篩選合適的碳氮源在提高香菇菌絲產量上十分重要。魏雅冬等[12]認為香菇對葡萄糖的利用效果較差，菌絲生物量最低，而在本試驗中，香菇0912菌株對速效碳源—葡萄糖的利用效果最好，這可能是由于菌株不同，其對葡萄糖的利用效果亦存在差異;土豆粉的營養成分含量較多，同樣適于菌絲生長;香菇菌絲對蔗糖的利用速率較慢，其原因有待于進一步研究;淀粉在高溫滅菌后需要被水解方可被利用，菌絲對淀粉的利用速率最差。總體來看，試驗中所采用的氮源均適合香菇0912菌絲的生長，但對玉米漿和麥麩的利用效率最高，考慮到麥麩會對菌絲干質量的結果造成誤差，故選用玉米漿為最佳氮源。pH值篩選結果表明香菇0912菌絲液體培養的最佳pH值為5，與徐思煒等[21]的研究結果一致。

將單因素試驗與正交試驗相結合，最終篩選出的適合香菇0912的液體培養基以及培養條件為：葡萄糖3%，玉米漿0.3 %，K2HPO4 0.05 %，KH2PO4 0.05%，MgSO4 0.05%，維生素B1 0.005%，pH值5.0，裝液量50 mL，接種量為直徑5 mm的菌塊3塊，培養溫度25? ℃，靜置時間24 h，轉速180 r·min-1，在此條件下菌絲干質量達到2.103 g·L-1，是優化前（1.417 g·L-1）的1.49倍。

在規模化生產中，液體菌種的培養主要靠發酵罐實現，本試驗通過搖瓶培養確定了可參考的香菇0912菌株培養基，而發酵罐和搖瓶的培養控制差異較大，其優化還有待在發酵罐中進一步開展試驗研究。

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