基于微流控技術的納升級蛋白質結晶篩選方法的研究進展

高潔 方群

摘?要?X射線晶體學技術是目前蛋白質結構測定中最主要的方法。為了得到滿足衍射要求的高質量蛋白質晶體，研究者通常耗費大量試劑和樣品進行大規模結晶條件篩選。微流控技術通過對超微量流體的操縱，可大幅降低在蛋白質結晶篩選中蛋白樣品的消耗。本文依據結晶方法，分別介紹了基于微批量法、蒸氣擴散法、自由界面擴散法和透析法的微流控蛋白質結晶篩選方法的研究進展。

關鍵詞?微流控技術; 蛋白質結晶篩選; 納升級; 評述

1?引 言

蛋白質作為一種生物大分子，其結構的測定對生命科學的發展具有重要意義。生物系統內的作用機制和進化過程都與蛋白質結構息息相關。蛋白質結構的測定有助于從原子層面理解生命活動，從而為疾病診斷和新藥設計提供新的基礎[1]。目前，蛋白質結構主要通過3種方法測定：X射線晶體學技術（X-ray crystallography）、核磁共振波譜技術（Nuclear magnetic resonance， NMR）和電子顯微鏡技術（Electron microscopy）。NMR技術可測定的蛋白質種類受限較大，要求測定對象須是中小分子量的可溶性蛋白，而且濃度為1 mmol/L時不聚集。電子顯微鏡借助電子衍射技術和單顆粒技術解析蛋白質結構，但電子衍射技術需蛋白質的二維晶體，而單顆粒技術解析蛋白質結構的分辨率不佳。近年來，冷凍電鏡技術（Cyro-electron microscopy， cryo-EM）的快速發展基本解決了借助單顆粒技術解析結構的分辨率問題，顯著提高了電鏡技術在蛋白質結構測定中的地位[2，3]。然而，X射線晶體學技術仍然是當前蛋白質結構測定中最主要的方法。該技術對蛋白質的分子量和可溶性沒有特殊要求，解析結構的分辨率能達到單個原子水平。同時，同步輻射光源、微量和自動化液體操作等相關技術的發展都在持續有力地推動該技術的進一步發展[4]。

目前，結構已被測定的蛋白質仍只占蛋白質總數的很小部分，據估計，每百個研究的蛋白質中，僅約兩個蛋白質的結構能被成功測定[5]。利用X射線晶體學技術進行蛋白質結構測定的主要瓶頸之一是難以獲得滿足衍射分析要求的蛋白質晶體。蛋白質結晶過程受到蛋白質純度和濃度、沉淀劑種類和濃度、pH值、添加劑、離子強度、溫度等眾多因素的影響[6]，上述因素的細微變化都可能產生不利于晶體衍射的晶體性質變化，如晶體尺寸小、形貌差、溶劑含量高、機械強度差等[4]。因此，高質量的蛋白質結晶需要依靠對成百上千個蛋白質結晶反應的篩選實驗實現，而很多珍稀蛋白質的樣品本身的制備量通常不足毫克[7]，這對篩選過程的微量化、規模化和自動化提出了很高的要求。

微流控技術是操縱微量流體的技術。將微流控技術用于蛋白質結晶篩選，具有以下優勢：（1）顯著降低蛋白樣品和沉淀劑的消耗，節約實驗成本，這一特點對難以表達和提純的珍稀蛋白質的意義尤為重要; （2）實現常規毫升和微升體積下無法完成的操作，如對分子擴散和晶體成核的精確控制[6]; （3）借助微體系下的自由對流環境，得到高質量晶體[8]; （4）自動化程度高，耗時少，篩選通量高。本世紀以來，微流控技術已成為蛋白質結晶篩選的有力工具，近年來，研究者分別從微流控蛋白質結晶方法[4，6，9～11]、微流控結晶裝置[12]和蛋白質結晶技術發展趨勢[13]等方面對相關領域的研究進展進行了綜述。本文依據結晶方法，對基于微流控技術的超微量納升級蛋白質結晶篩選方法進行了評述。

2?納升級蛋白質結晶篩選方法

蛋白質結晶反應是蛋白質在溶液中的相轉變[14]，當溶液中的蛋白質和沉淀劑濃度達到相圖中的過飽和區域時，蛋白質分子開始成核，從溶液中析出，蛋白質濃度減小。整個體系由成核區域（Nucleation zone）向亞穩區域（Metastable zone）轉變，此時成核不再發生，晶體開始生長，最終達到溶解度曲線（Solubility curve）。微批量法（Microbatch）、蒸氣擴散法（Vapour diffusion）、透析法（Dialysis）和自由界面擴散法（Free interface diffusion， FID）是常見的蛋白質結晶方法，基于這4種方法的體系在晶體成核前的路徑是不同的，但成核開始后，路徑統一[6]， 表1比較了4種結晶方法的優點與不足。由于微批量法的實驗裝置結構簡單，早期基于微流控技術的納升級蛋白質結晶篩選多選用微批量法為結晶方法。在此基礎上，研究者逐步實現了基于其它結晶方法的結晶實驗。

2.1?基于微批量法的納升級蛋白質結晶篩選系統

基于微批量法的蛋白質結晶反應是指蛋白質溶液和沉淀劑溶液以特定濃度混合，形成蛋白質結晶反應器，在蛋白質分子成核前，反應器內各組分的濃度均保持不變[14]。微批量法由Chayen等[15]于1990年首次提出，為防止微量樣品和試劑蒸發，大部分基于微批量法的結晶實驗在油下進行，故亦稱為油下微批量法（Microbatch under oil）[16]。該方法的優點主要有：蛋白質和沉淀劑濃度可準確控制，有利于對整個蛋白質結晶過程進行研究，如相圖的繪制; 油下加樣與反應受水相蒸發的影響很小，有利于實現篩選的微量化和規模化; 蛋白質結晶篩選可在不同溫度下進行，以獲得更多結晶條件[17]; 通過改變油的種類和配比，可以實現油下的蒸氣擴散法[18]，將兩種結晶方法的優勢有效地結合起來。微批量法的局限性主要在于成核前的蛋白質和沉淀劑濃度在反應器中保持不變，無法實現對濃度的篩選，沉淀劑中無法使用溶于油或與油反應的有機試劑，蛋白質初始濃度過高，容易產生碎晶和沉淀。

2.1.1?連續流液滴技術?Ismagilov研究組[19]利用T型通道連續流液滴技術[20]，發展了一種有效調節納升級液滴組成的蛋白質結晶篩選芯片。通過改變匯流通道內不同試劑的流速形成不同試劑配比的液滴，進行基于微批量法的蛋白質結晶篩選。該芯片每秒生成數個蛋白質和沉淀劑含量不同的液滴，每個液滴的蛋白樣品消耗為4 nL甚至更少，實現了高通量和低消耗篩選蛋白質結晶。基于該方法，Gerdts等[21]使用名為Microcapillary Protein Crystallization System（MPCS）[22]的結晶系統，通過濃度梯度的篩選，用微批量法對29種蛋白質的基于常規蒸氣擴散法的結晶實驗進行重復，成功結晶了其中28種蛋白質。 此外，Pham等[23]將該方法和小角X射線散射（Small-angle X-ray scattering， SAXS）技術結合，生成的液滴流經X射線束，記錄SAXS數據，用于研究溶液中的蛋白質結晶過程，顯著降低了樣品和時間消耗。為了將連續流液滴技術應用于基于蒸氣擴散法的蛋白質結晶實驗，Ismagilov研究組[24]采用雙匯流通道，交替間隔形成結晶液滴和高濃度鹽液滴。相鄰的液滴組成基于蒸氣擴散法的蛋白質結晶反應器。通過調節試劑流速即可改變液滴間距，并以此調節蒸氣擴散速率，有助于獲得理想的結晶結果。

本研究組發展了一種可進行快速進樣和試樣更換的連續流液滴篩選系統[25]。該系統中，不同的沉淀劑儲于缺口管陣列中，蛋白樣品和緩沖液儲于芯片上的儲液池中，三者匯合后，通過十字通道生成液滴，形成基于微批量法的蛋白質結晶反應器。該系統的優勢在于通過移動缺口管陣列，芯片上的取樣探針可劃過不同的缺口管吸入不同的沉淀劑，從而使連續流液滴技術能夠用于不同沉淀劑的篩選實驗，且單種沉淀劑蛋白樣品消耗僅為2.4 nL。

2.1.2?液滴儲存器技術?為了篩選不同的沉淀劑，Ismagilov研究組發展了一種液滴儲存器（Droplet cartridge）技術[26]，用于蛋白質結晶篩選。其方法是將沉淀劑液滴預先引入毛細管中儲存，再通過漏斗型接口將毛細管和芯片的T型通道連接，分別通入蛋白質溶液和沉淀劑液滴，兩者融合生成結晶反應器液滴，流入下游的的毛細管中，進行基于微批量法的蛋白質結晶反應。液滴儲存器易操作且低消耗[27]，篩選48個條件所消耗的蛋白樣品少于1 μL。

2.1.3?液滴組裝技術?本研究組[28]基于液滴組裝技術，發展了一種自動化的微流控液滴篩選平臺——液滴實驗室（DropLab），并將其應用于蛋白質結晶篩選。該系統利用拉尖的毛細管依次吸取蛋白質溶液、沉淀劑和油相，直接組裝生成結晶反應器液滴，進行基于微批量法的蛋白質結晶反應，篩選50個不同的沉淀劑共消耗蛋白樣品300 nL。

2.1.4?滑動芯片技術?Ismagilov研究組[29]在基于基片的預裝載技術[30]的基礎上，發展了一種滑動芯片（Slipchip）技術，用于蛋白質結晶篩選。實驗時先將預先生成的沉淀劑液滴加入下層基片的微孔中，再滑動上層基片，使上層基片的微孔和下層基片的微槽連成一條完整的通道，然后從通道一端通入蛋白樣品，使上層基片的微孔中充滿樣品，最后再滑動上層基片，使上下兩層基片的微孔對準，沉淀劑和蛋白樣品混合，形成基于微批量法的蛋白質結晶反應器。該方法的優點在于芯片結構簡單，無須鍵合，且操作過程不用借助泵和閥，受實驗條件限制小。每個反應僅消耗蛋白樣品5 nL，單塊芯片可同時完成48個結晶反應篩選。該研究組[31]將滑動芯片進一步改進，簡化了沉淀劑裝載的方法，實現了蛋白質和沉淀劑不同混合比例的篩選。他們還通過改變芯片結構在滑動芯片上實現了基于自由界面擴散法的蛋白質結晶篩選[32]。上層基片上加工的微槽，在裝載試劑和樣品時用于連接微孔，在反應發生時作為自由界面擴散的通道，下層基片上加工有裝載沉淀劑和蛋白樣品的微孔。通過改變通道尺寸及對應微孔之間的距離，獲得不同的擴散平衡時間，增加了篩選條件的多樣性。

2.1.5?離心芯片技術?Li等[33]利用毛細作用和離心力驅動技術發展了一種用于納升級蛋白質結晶篩選的微流控離心芯片。先將沉淀劑和蛋白質溶液加入相應的芯片通道入口，溶液在毛細作用下流入并充滿對應的通道，由于毛細截止閥的作用，溶液無法流入反應腔室內。然后，在大于6000 r/min的轉速下將芯片離心1 min，通道中的沉淀劑和蛋白質溶液在離心力驅動下，進入反應腔室并混合。最后，加油密封，形成基于微批量法的蛋白質結晶反應器。每個結晶反應消耗試劑31 nL，單塊芯片可同時完成24個反應。為了在離心芯片上實現基于蒸氣擴散法的蛋白質結晶篩選，該研究組[34]對該芯片進行改進，增加了沉淀劑儲存通道和蒸氣擴散腔室。蒸氣擴散腔室和反應腔室、沉淀劑儲存通道以細通道相連接，形成二級毛細截止閥。6000 r/min的轉速只能使通道中的溶液沖破一級毛細截止閥，而無法通過二級毛細截止閥，在擴散腔室保留氣體空間以進行蒸氣擴散。采用該芯片篩選得到的結晶條件多于傳統懸滴法。

2.1.6?濃度梯度技術?Yang等[35]將其研制的濃度梯度芯片[36，37]進行改進，用于納升級蛋白質結晶篩選。該芯片包含濃度梯度形成通道、油相通道和液滴生成通道。濃度梯度形成原理為，兩種溶液在弧形通道匯合，以1：1的比例流入直型通道，混合后的溶液在下一級的弧形通道重復以上過程，每種溶液在流經一級弧形和直型軌道后，產生3種不同濃度的溶液[36]。在蛋白質結晶篩選實驗中，沉淀劑、蛋白樣品或兩者的混合溶液從水相入口通入，經過濃度梯度形成區域形成不同配比的結晶反應溶液，然后借助T型通道生成液滴，形成基于微批量法的結晶反應器。通過調節油相的流速可改變生成液滴的體積，最小可達到0.57 nL，在單塊芯片上，可同時完成5種沉淀劑各8個不同濃度的篩選。

Abdallah等[38]利用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）材料加工了一個微流控濃度梯度裝置，用于蛋白質結晶篩選。該裝置分為流體層、薄膜和控制層，薄膜呈自然狀態時，閥門呈關閉狀態。先將負壓施加于控制層，薄膜向下彎曲，閥門打開。再將正壓施加于流體層，推動兩個入口的純水和沉淀劑進入通道，清洗裝置。然后將清水更換為蛋白樣品，使沉淀劑和蛋白樣品在每個微孔中以不同的比例混合。最后向控制層加正壓，閥門關閉，形成基于微批量法的結晶反應器。每個反應器僅消耗蛋白樣品25 nL，共形成170個不同濃度的結晶反應器。

2.1.7?順序操作液滴陣列技術?本研究組[39]將順序操作液滴陣列（Sequential operation droplet array， SODA）技術[40]應用于納升級蛋白質結晶篩選。實驗中，先將毛細管、玻璃芯片和儲液池固定在液滴機器人的特定位置，利用自動平移臺按計算機程序操縱毛細管逐個從多孔板儲液池中吸取沉淀劑，注入芯片上的微孔內形成沉淀劑液滴，待生成由不同的沉淀劑液滴構成的液滴陣列后，再操縱毛細管吸取蛋白樣品溶液，并依次將定體積蛋白質溶液加入每個沉淀劑液滴內。蛋白質加入操作采用半接觸點樣方式進行，避免產生不同沉淀劑之間的交叉污染。上述操作均在油的覆蓋下完成，蛋白樣品與沉淀劑液滴混合形成基于微批量法的結晶器。借助SODA技術生成的液滴體積僅為4～8 nL，每種蛋白樣品篩選的結晶條件最多達到96個，且有向更大篩選規模拓展的潛力。

2.2?基于蒸氣擴散法的納升級蛋白質結晶篩選系統

蒸氣擴散法是目前常規蛋白質結晶篩選中使用最廣泛的方法[14]。基于蒸氣擴散法的蛋白質結晶反應器通常由兩部分組成，較低濃度的蛋白質與沉淀劑混合溶液反應器和高濃度沉淀劑儲液池。由于反應器中的水分經由擴散途徑向儲液池擴散，處于不飽和區域的蛋白質和沉淀劑濃度逐漸升高，進入過飽和區域，蛋白質分子開始成核。蒸氣擴散發生的過程，本身就自動完成了對蛋白質和沉淀劑濃度的篩選。該方法的優點主要有：通過對濃度的篩選提高篩選成功率; 通過調節儲液池中溶液的濃度，可靈活控制反應器中的各個成分及濃度; 通過改變反應器和儲液池之間的距離，可調節擴散速率。蒸氣擴散法的局限性主要在于體系較為復雜，且其蒸氣擴散是動態過程，一旦實驗開始，條件難以精確定量控制。同時，揮發性試劑和溫度的變化對結晶反應影響較大，可能會造成晶體溶解。

2.2.1?超聲液滴噴射技術?超聲液滴噴射技術是一種微量液滴操縱技術，通過超聲發生器將超聲能量聚焦于液氣界面上，噴射出微量液滴。由于其完全非接觸式的液滴操縱方式，可有效解決不同樣品/試劑之間的交叉污染和樣品吸附問題。將該技術用于蛋白結晶篩選，在提升晶體質量[41]和提高篩選通量[42]方面具有優勢。Teplitsky等[43]利用Labcyte公司的Echo 550超聲液滴操縱儀器，進行了蛋白質之間或與小分子和配體的共結晶實驗。實驗中，由超聲液滴操縱儀器向孔板內噴射2.5 nL蛋白樣品、2.5 nL沉淀劑和2.5 nL小分子溶液，組成一個混合液滴。孔板的儲液池中存有母液，孔板蓋能夠防止液滴向外界蒸發，因此每個液滴在孔板中形成基于蒸氣擴散法的蛋白質結晶反應器。每個孔可容納18個液滴， 在一個96孔板中能同時進行1728個結晶反應。

2.2.2?3D打印芯片技術?本研究組[44]將3D打印技術應用到液滴陣列芯片的加工中，結合SODA技術，發展了一種基于蒸氣擴散法的納升級蛋白質結晶篩選方法系統。利用3D打印技術可在加工出具有高深寬比，且深度不同的微孔結構。3D打印芯片的表面有一層聚對二甲苯（Parylene）涂層，借助該涂層和熔融石蠟填充，可封閉3D打印材料內的微孔隙，保證芯片的密封性和穩定性。實驗中，借助液滴操縱機器人在毛細管中吸入沉淀劑和蛋白樣品，注入加油的結晶液滴孔中生成結晶液滴，再向沉淀劑孔中加入高濃沉淀劑，最后密封形成基于蒸氣擴散法的結晶反應器。每個反應器僅消耗蛋白樣品10 nL，每塊芯片中可完成84個結晶反應，且能通過控制油層厚度調節蒸氣擴散速度。

2.3?基于透析法的納升級蛋白質結晶篩選系統

透析法是基于透析膜的一種蛋白質結晶方法，利用透析膜將蛋白質和沉淀劑分隔，蛋白質因分子量較大無法通過透析膜，而小分子沉淀劑可以透過[6]。在基于透析法的結晶實驗中，蛋白質一側的蛋白濃度始終保持不變，而沉淀劑由另一側通過透析膜擴散進入蛋白質一側，在結晶過程中，其濃度逐漸升高，直至使結晶反應進入成核區域。此外，還有一類透氣膜也被用于類似透析法的蛋白質結晶篩選中，只有水和小分子量有機溶劑的蒸氣能夠通過該透氣膜，而鹽、高分子和蛋白質都無法通過，這使得溶液中所有成分的濃度可快速、精確地可逆轉變[45]。相較于其它幾種蛋白質結晶方法，透析法能可逆地調節結晶反應器內的濃度，將晶體成核和生長過程分開，獨立地進行濃度優化。因此，基于透析法的蛋白質結晶篩選系統的最大的優點在于能夠得到高質量的大晶體，而其不足是體系較復雜，且實現高通量篩選難度較大。

Shim等[45]結合透析法和晶種法的優勢發展了一種相芯片（Phase chip），該芯片以一層15 μm厚的PDMS為透氣膜。實驗中，先將1 nL蛋白質結晶液滴引入裝置中，液滴會在表面張力的驅動下有序地進入每個微孔中。在儲液池中通入空氣或高濃度的鹽溶液，液滴中的水分通過PDMS膜向儲液池擴散，液滴中各組分的濃度升高，進入過飽和區域，蛋白質分子成核，出現大量小晶體。然后，在儲液池中通入純水，純水向結晶液滴擴散，各組分的濃度變低，小晶體（晶種）溶解到溶液中，這一現象有利于大晶體的生長，從而獲得大尺寸、高質量的晶體。

2.4?基于自由界面擴散法的納升級蛋白質結晶篩選系統

自由界面擴散法又稱液-液擴散法，是指兩種溶液通過微通道相連，溶液中的組分通過兩溶液界面進行自由擴散。在基于自由界面擴散法的蛋白質結晶反應中，對于蛋白質溶液一側，反應初始時，蛋白質濃度最高，而沉淀劑濃度為0。隨著擴散的進行，蛋白質濃度逐漸降低，同時沉淀劑濃度逐漸升高，進入過飽和區域，蛋白質分子開始成核。自由界面擴散法的優點是成核概率高，且晶體質量好。但該方法樣品消耗量較大，且存在重力的混雜效應，在蛋白質結晶領域并不常用[46]。引入微流控技術后，上述兩個問題均被解決，自由界面擴散法在該領域得到了一定應用。

Quake研究組[47]利用PDMS微泵微閥技術[48]發展了一種基于自由界面擴散法的蛋白質結晶芯片。通過控制微閥使沉淀劑和蛋白質溶液分別進入各自的反應微孔，再打開連接兩微孔通道上的微閥，使兩種溶液形成擴散界面，進行基于自由界面擴散法的蛋白質結晶反應。該芯片在單個反應平均消耗12.5 nL蛋白質溶液的條件下，相較傳統方法出晶概率更高、出晶速度更快、晶體質量更好。Maeki等[49]對該方法進行改進，將兩側微孔中的溶液改為結晶溶液和晶種溶液，將自由界面擴散法和微晶種法結合，從而控制蛋白質結晶過程，用于研究有限空間內蛋白質晶體的生長行為。Quake研究組[50]還將基于自由界面擴散法和蒸氣擴散法的蛋白質結晶實驗集成在一塊芯片上進行。蒸氣擴散通過反應微孔和儲液池之間的一層透氣PDMS薄膜實現。該芯片通過滲透浴強度調節蒸氣擴散速率，通過通道長度控制自由界面擴散速率，從而實現蛋白質結晶條件的動態優化。

基于PDMS微泵微閥技術，Quake研究組[51]還發展了一種配比芯片（Formulator chip），該芯片由液體量取和液體混合兩個結構單元組成，能在5 nL的反應器中快速混合蛋白樣品和沉淀劑，用于系統地研究蛋白質相行為。Hansen研究組[52]在配比芯片的基礎上，結合液滴技術，發展了一個集成試劑混合、液滴生成和晶體孵育的微流控蛋白質結晶篩選平臺。實驗芯片中，沉淀劑和蛋白樣品在5 nL的圓環中混合后，借助油相生成納升級液滴，形成基于微批量法的蛋白質結晶反應器。

該平臺的優點為在每個反應的樣品消耗低于5 nL的情況下集成實現了蛋白質相圖研究和結晶篩選實驗。

2.5?其它納升級蛋白質結晶篩選方法

Feuerborn等[53]利用水相在油水間隔流中的水平對流在反應溶液中形成濃度梯度，用于進行蛋白質結晶篩選。實驗中，先在充滿油相FC-40的Teflon管中通入少量空氣，再通入60 nL蛋白樣品，然后間隔通入油和20 nL沉淀劑，形成5個沉淀劑液滴。當管內液體開始流動時，由于不同物質在FC-40中的界面張力不同，水相液滴的移動速度>油相液滴速度>氣泡速度，使水相液滴包裹住油相液滴，形成一個大液滴，并產生水平對流。大液滴中油相間隔的半開放反應腔室與蛋白樣品向后方的對流形成了濃度梯度，晶體在合適的濃度孵育生成。

3?總結與展望

近十幾年來，基于微流控技術的納升級蛋白質結晶篩選方法得到了飛速發展。利用微流控技術，常規體系下的基于微批量法、蒸氣擴散法、透析法和自由界面擴散法的蛋白質結晶反應都能在微體積下實現。此外，微流控蛋白質結晶芯片材料的發展，顯著地推動了原位衍射技術[54]在蛋白質結晶篩選領域的發展。芯片材質由玻璃[55]和PDMS[50]，發展到聚碳酸酯（Polycarbonate， PC）[22]、聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl methacrylate， PMMA）[56]、環烯烴共聚物（Cyclic olefin copolymer， COC）[57，58]和聚酯薄膜（Mylar）[59，60]等材料，使得通過微量的蛋白質結晶反應即有可能獲得用于結構解析的全套衍射數據。

盡管基于微流控技術的納升級蛋白質結晶篩選系統具有低消耗、集成化、自動化、對結晶反應的操控性強、利于成核和晶體生長、可用于原位衍射等優點，但目前文獻報道的大部分系統的應用還停留于模型蛋白的結晶篩選水平，尚未應用于實際蛋白樣品的篩選。這可能主要是由兩個原因造成的： （1）多數納升級蛋白質結晶篩選系統的篩選規模不大，篩選沉淀劑的種類尚未達到實際蛋白樣品結晶條件初篩的要求; （2）相較于商業化蛋白質結晶篩選儀器[61]，微流控系統在通量、操作難度和自動化程度等方面，尚存在一定劣勢。相信隨著微流控技術的進一步發展，微流控蛋白質結晶篩選系統能夠解決上述問題，從而應用于實際蛋白樣品的篩選， 為蛋白質結構測定提供強有力的工具。

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